雞源福氏志賀氏菌的分離鑒定及藥敏試驗

張丹鶴，蔣媛媛，許蘭菊，楊永珍，鄧久虎，苗銀萍

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州450002)

志賀氏菌(Shigella)是人類細菌性痢疾最為常見的病原菌，俗稱痢疾桿菌.根據(jù)O抗原的不同，志賀氏菌屬可分為痢疾志賀氏菌(S.dysenteriae)、福氏志賀氏菌(S.flexneri)、鮑氏志賀氏菌(S.boydii)和宋內(nèi)氏志賀氏菌(S.sonnei)4 個群［1］.近年國內(nèi)外報道，志賀氏菌除感染人外，還能感染猴、犢牛、奶牛、仔豬、幼犬、雞、鴨、小鼠、豚鼠、袋鼠等多種動物，嚴重危害人和動物的健康［2～12］.2004 年許蘭菊等［2］首次從自然發(fā)病雞體內(nèi)分離到雞源志賀氏菌，根據(jù)研究雞源志賀氏菌在生物學(xué)及血清學(xué)特性等方面與人志賀氏菌相同.雞源志賀氏菌可引起雞的腹瀉痢疾、血便，重者引起死亡.剖檢可見明顯的腸道病變，耐過雞消瘦和生長發(fā)育遲緩.雞志賀氏菌病是雞的一種新發(fā)傳染病，常被誤診為雞白痢或雞球蟲病等，給該病防治造成很大困難，結(jié)果導(dǎo)致了嚴重的經(jīng)濟損失［2，13］.2009-03 新鄭某雞場的8月齡蛋雞雞群發(fā)生嚴重腹瀉，本研究針對腹瀉病雞采集典型病料進行病原菌分離鑒定，結(jié)果分離到雞源福氏志賀氏菌，并對其病原特性進行了研究，為該病的確切診斷和有效防治提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 雞群發(fā)病情況及病料來源

2009-03-16新鄭某養(yǎng)雞戶前來就診，該雞場本批共飼養(yǎng)蛋雞3 000只，8月齡時雞群發(fā)病.雞群發(fā)病后大部分雞的采食量和產(chǎn)蛋量下降，并具有嚴重腹瀉拉稀癥狀，部分雞只發(fā)生死亡.剖檢病變可見十二指腸出血性炎癥.無菌操作采集病死雞的十二指腸及其腸內(nèi)容物，備檢.

1.2 試驗動物及分組

1日齡羅曼商品代蛋公雛40只，購自鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校孵化場.按正常標準飼養(yǎng)管理，隔離觀察3 d后雞只均正常.隨機抽取5只雛雞采血分離血清，經(jīng)檢測雞白痢雞傷寒沙門氏菌和志賀氏菌抗體均為陰性.將剩余的35只雛雞隨機分為7個小組，每組5只;分別為空白對照組、質(zhì)量分數(shù)1%葡萄糖肉湯對照組和5個攻毒組.

1.3 培養(yǎng)基與染色液

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基、西蒙氏枸櫞酸鹽瓊脂培養(yǎng)基;6種細菌微量生化反應(yīng)管有葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖、尿素.以上培養(yǎng)基和微量生化管均由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)，均在有效期內(nèi)按說明書使用.質(zhì)量分數(shù)1%葡萄糖肉湯用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基按1%比例加入葡萄糖配制成.

革蘭氏染色液1套，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院畜禽疫病細菌分子生物學(xué)與免疫學(xué)實驗室配制保存.

1.4 志賀氏菌屬診斷血清和雞源志賀氏菌多價凝集抗原

志賀氏菌屬4種多價診斷血清，福氏多價診斷血清，痢疾1型診斷血清，痢疾2型診斷血清，宋內(nèi)Ⅰ相診斷血清(史密氏)，鮑氏多價(1-5型)診斷血清，均由寧波天潤生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，且在有效期內(nèi).雞源志賀氏菌多價凝集抗原由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院畜禽疫病細菌分子生物學(xué)與免疫學(xué)實驗室研制保存.

1.5 藥敏紙片

藥敏紙片共12種，分別為阿莫西林(AMX，10 μg·片-1)、氨芐/舒巴坦(AM/SU，10/10 μg·片-1)、頭孢曲松(CRO，30 μg·片-1)、頭孢唑啉(CZ，30 μg·片-1)、羅紅霉素(ROX，15 μg·片-1)、慶大霉素(GM，10 μg·片-1)、阿米卡星(AN，30 μg·片-1)、米諾環(huán)素(MNO，30 μg·片-1)、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶(STX，23.75/1.25 μg·片-1)、環(huán)丙沙星(CIP，5 μg·片-1)、諾氟沙星(NOR，10 μg·片-1)、氧氟沙星(OFL，5 μg·片-1)，均由北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)，且在有效期內(nèi).

1.6 細菌分離培養(yǎng)及抹片染色鏡檢

首先將采集病料分別接種于質(zhì)量分數(shù)1%葡萄糖肉湯，置37℃18～24 h增菌培養(yǎng).然后將增菌培養(yǎng)物分別劃線接種于SS瓊脂平板及麥康凱瓊脂平板，置37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落培養(yǎng)性狀.

對上述細菌分離培養(yǎng)呈現(xiàn)的典型菌落進行細菌抹片、革蘭氏染色和顯微鏡油鏡觀察.

1.7 細菌生化試驗

挑取SS瓊脂平板及麥康凱瓊脂平板上的典型菌落接種于質(zhì)量分數(shù)1%的葡萄糖肉湯進行純化培養(yǎng)18 h，然后將純化培養(yǎng)菌液分別接種葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖、尿素細菌微量生化反應(yīng)管，用穿刺法接種三糖鐵瓊脂斜面和西蒙氏枸櫞酸鹽瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d，每24 h觀察并記錄1次結(jié)果.MR試驗、V-P試驗、吲哚試驗和明膠液化試驗均按照文獻［14］進行.

1.8 細菌動物攻毒試驗

將雞源志賀氏菌分離菌株分別接種于質(zhì)量分數(shù)1%葡萄糖肉湯，37℃培養(yǎng)24 h，然后進行菌落計數(shù)，每毫升約含菌22.08×108個.采用腹腔注射的方法對3日齡雛雞進行攻毒，攻毒組注射不同菌株的肉湯培養(yǎng)物0.2 mL·只-1，肉湯對照組腹腔注射滅菌質(zhì)量分數(shù)1%葡萄糖肉湯0.2 mL·只-1，空白對照組不做任何處理.攻毒組和對照組分別進行隔離飼養(yǎng)，每2 h觀察并記錄雛雞的表現(xiàn)，對病死雞及時進行剖檢，7 d后對攻毒的存活雞全部剖檢，觀察記錄剖檢病變，采集病料，進行細菌回收試驗.

1.9 細菌血清學(xué)鑒定

1.9.1 抗原制備 將初步判定的雞源志賀氏菌分離株接種營養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h后，將細菌用少量體積分數(shù)0.5%的石炭酸生理鹽水(pH值為7.2)洗下，制成菌懸液，然后經(jīng)121～126℃高壓滅活2 h破壞細菌的K抗原.用麥氏比濁管進行比濁，調(diào)整抗原的最終濃度為40×108個·mL-1，按6%的比例加入堿性美蘭染液混勻，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.9.2 平板凝集試驗 取制備好的細菌抗原50 uL于白瓷板孔中，再加入等量的志賀氏菌屬診斷血清，輕搖混勻后，同時設(shè)標準陽性、陰性對照以及抗原對照，3～5 min后觀察結(jié)果.結(jié)果判定方法參照文獻［14］.

1.10 細菌藥敏試驗

采用紙片擴散法，檢測5個雞源志賀氏菌分離株對阿莫西林等12種藥物的敏感性.試驗方法參照文獻［16］進行，結(jié)果判定標準按產(chǎn)品說明書.

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離培養(yǎng)結(jié)果

將增菌液在SS瓊脂和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種，37℃培養(yǎng)24 h后，均可見圓形、微凸、邊緣整齊、無色、半透明、直徑1～2 mm的小菌落，未見到其它形態(tài)的菌落.

2.2 細菌形態(tài)及染色特性

對分離的菌落進行細菌抹片、革蘭氏染色和鏡檢.結(jié)果均為革蘭氏陰性短小桿菌.

2.3 細菌生化試驗結(jié)果

結(jié)果見表1.其中1號、2號和5號菌株分離自十二指腸，3號和4號菌株分離自十二指腸腸內(nèi)容物.根據(jù)試驗結(jié)果，初步判定5株分離菌均為雞源志賀氏菌.

表1 5個分離菌株的生化試驗結(jié)果Table1 Biochemical test results of five isolations

2.4 細菌動物攻毒試驗結(jié)果

攻毒后，部分雞出現(xiàn)腹瀉拉稀、血便癥狀，重者死亡.剖檢可見雞的腸道出血性炎癥、肝臟腫大等病變.經(jīng)病原菌分離均可回收到攻毒菌.試驗結(jié)果見表2，菌株編號同生化試驗.

表2 5株雞源志賀氏菌攻毒試驗結(jié)果Table2 Challenge experiment results of five strains of shigella isolated from chicken

2.5 細菌血清學(xué)鑒定結(jié)果

對初步判定的5株雞源志賀氏菌，用志賀氏菌屬診斷血清進行平板凝集試驗.經(jīng)鑒定5個分離菌株均為雞源福氏志賀氏菌.結(jié)果見表3.

2.6 細菌藥敏試驗結(jié)果

由表4可見，這5株雞源福氏志賀氏菌對阿莫西林、頭孢唑林、頭孢曲松、慶大霉素、磺胺甲噁唑、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和氧氟沙星這8種藥物都表現(xiàn)出耐藥性.1號菌株對12種藥物均耐藥;2號菌株對阿米卡星敏感，對其它藥物耐藥;3號菌株對氨芐/舒巴坦、阿米卡星和米諾環(huán)素敏感，對羅紅霉素的敏感性為中介;4號菌株對氨芐/舒巴坦和阿米卡星的敏感性為中介，對其它藥物耐藥;5號菌株對氨芐/舒巴坦敏感，對阿米卡星和米諾環(huán)素的敏感性為中介，對其它藥物耐藥.

表3 5株雞源志賀氏菌的血清學(xué)試驗結(jié)果Table3 Serologic test results of five strains of shigella isolated from chicken

表4 5株雞源志賀氏菌的藥敏試驗結(jié)果Table4 Drug sensitive test results of five strains of shigella isolated from chicken

3 小結(jié)與討論

本研究經(jīng)細菌分離鑒定對新鄭發(fā)生嚴重腹瀉的病雞群進行了病原診斷，分離出5株雞源福氏志賀氏菌，且動物攻毒試驗表明分離菌株具有明顯的致病性.因此，該雞群發(fā)生腹瀉病是由雞源福氏志賀氏菌所引起.藥敏試驗結(jié)果顯示，5個分離菌株對阿莫西林等12種藥物具有多重耐藥性，其中4個菌株對阿米卡星和氨芐/舒巴坦較敏感.

許蘭菊等［15］利用研制的雞源志賀氏菌平板凝集抗原及平板凝集試驗，對中國河南、山東等不同地區(qū)雞志賀氏菌病的發(fā)病率、流行地區(qū)、品種、日齡及其混合感染等進行了血清流行病學(xué)調(diào)查.結(jié)果表明:中國部分地區(qū)存在有雞源志賀氏菌感染，其血清抗體陽性率較高，達28.13% ～33.17%，已遠遠超過雞白痢雞傷寒(1.4%).本研究從腹瀉病雞中分離出雞源福氏志賀氏菌，進一步說明雞志賀氏菌病在河南省部分地區(qū)呈流行趨勢，且存在雞源志賀氏菌種和型的差異.

本試驗分離的5株雞源志賀氏菌，雖然其生化特性與醫(yī)學(xué)有關(guān)文獻報道的志賀氏菌屬特性不是完全符合，但分離菌株經(jīng)血清學(xué)鑒定均為雞源福氏志賀氏菌.細菌菌屬的生化特性標準是相對于大多數(shù)菌株，細菌菌屬的各項生化特性指標在不同的菌株間存在有一定的(0% ～10%)差異［16］.菌株的生化特性可以作為細菌鑒定中判定屬和種的參考依據(jù)，但不能作為判定細菌屬和種的唯一標準.志賀氏菌各型之間的生化特性會有一定的差別，志賀氏菌亞群一般通過其生化特性的差異來區(qū)分，且常和血清學(xué)方法結(jié)合起來進行鑒定［17］.因此，本研究除細菌生化試驗外，又進行了血清學(xué)特異性試驗等.因此，本研究細菌鑒定結(jié)果是可靠的.由于本次試驗所用血清的種類有限，未能將分離菌株鑒定到型及亞型，有待今后進一步研究.

動物攻毒試驗結(jié)果表明，分離的5個雞源志賀氏菌菌株可使攻毒雞發(fā)生腹瀉和死亡.這進一步說明分離的雞源志賀氏菌菌株對雞具有一定的毒力和致病性.一旦雞群發(fā)生志賀氏菌病得不到有效治療，就會給養(yǎng)殖戶帶來很大的經(jīng)濟損失.因此，找出防治雞志賀氏菌病的有效藥物顯得尤其重要.從藥敏試驗結(jié)果來看，5株雞源福氏志賀氏菌對阿莫西林等8種藥物都表現(xiàn)出耐藥性.1號菌株對12種藥物均產(chǎn)生了耐藥性，其余菌株對氨芐/舒巴坦、阿米卡星和米諾環(huán)素的敏感性存在一定的差異.本次試驗分離菌株具有多重耐藥性，這可能與該地區(qū)養(yǎng)殖水平和用藥習(xí)慣、獸藥質(zhì)量問題及飼料中長期添加某些抗菌類藥物等因素有關(guān)［18］.因此，建議臨床治療要合理用藥，選擇敏感藥物進行治療，避免盲目性，盡量減少不必要的經(jīng)濟損失.

［1］ 陸德源.醫(yī)學(xué)微生物學(xué)［M］.第5版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:119-120.

［2］ 許蘭菊，王川慶，胡攻政，等.雞志賀氏菌在我國的發(fā)現(xiàn)及其病原特性研究［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2004，26(4):281-286.

［3］ 韋 毅，佟 飛，劉自民.廣西食蟹猴群中志賀氏菌的檢出、分型以及對抗菌藥物的敏感試驗［J］.實驗動物科學(xué)與管理，1999，16(4):6-9.

［4］ MAURELLI A T，ROUTH PR，DILLMAN R C，et al.Shigella infection as observed in the experimentall inoculated pig［J］.Susscrofa Domestica Microb Pathog，1998，25(4):189-196.

［5］ ALABOUDI A R，HAMMED D A，BASHER H A.Potential pathogenic bacteria from dead in shell chicken embryos［J］.Journal of Veterinary Sciences，1992，5(2):109-114.

［6］ TIWARY B K，PRASAD L B.Enteric infection in livestock and poultry caused by Salmonellae and Shigella［J］.Vet Rec，1972，91(21):510-513.

［7］ 喻華英，胡文兵，陳長生.犢牛腹瀉病中志賀氏菌分離與鑒定［C］//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)病理學(xué)分會第14次學(xué)術(shù)研討會暨中國病理生理學(xué)會動物病理生理專業(yè)委員會第13次學(xué)術(shù)會議論文集.石河子:中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)病理學(xué)分會，2006:261-265.

［8］ 王彥紅，苗小青，周 瓊，等.奶牛大腸桿菌與鮑氏志賀氏菌混合感染的診療［J］.中國獸醫(yī)雜志，2007，43(9):70-71.

［9］ 楊 雪，郭定宗，祝海寶，等.某豬場斷奶腹瀉仔豬致病菌的調(diào)查［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2007，34(8):114-116.

［10］高鳳山，胡佳學(xué).幼犬志賀氏菌感染的微生物學(xué)診斷［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報，2007，13(3):118.

［11］耿長國，彭廣能，何春燕，等.袋鼠源志賀氏茵的分離鑒定［J］.中國獸醫(yī)雜志，2009，45(11):33.

［12］鄒 玲.一株鴨源志賀氏菌的分離鑒定與藥敏試驗［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2009，36(5):164.

［13］李 煒，蔣大偉，程 琨，等.雞志賀氏菌多價凝集抗原及其標準血清的研制［J］.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，43(5):526-530.

［14］崔保安.動物微生物學(xué)［M］.第3版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2005:391.

［15］張玉紅，張光輝，許蘭菊，等.河南省雞志賀氏菌病和雞白痢的血清流行病學(xué)調(diào)查［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(12):105-108.

［16］陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)［M］.第3版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2001:29;216.

［17］楊 霞，陳 陸，許蘭菊，等.雞源鮑氏志賀菌 hn03株的分子鑒定與演化分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2009，40(3):408.

［18］李淑梅，楊 帆，劉興友.豫北地區(qū)規(guī)?；u場病原菌及耐藥性趨勢的調(diào)查［J］.養(yǎng)禽與禽病防治，2008(9):7-9.