RAEBT型骨髓增生異常綜合征患者白血病相關(guān)融合基因分析（附病例報(bào)告）

吳強(qiáng)強(qiáng)，王冬青，郝紅峰，岳 青，王桂臣，孫黎飛

骨髓增生異常綜合征 （myelodysplastic syndrome，MDS）是一組由于造血干細(xì)胞異質(zhì)性克隆導(dǎo)致的疾病。MDS臨床表現(xiàn)較為復(fù)雜，通常表現(xiàn)為外周血一系至三系降低，骨髓增生異常，并伴有造血細(xì)胞病態(tài)造血，其最終發(fā)展結(jié)局并不一致，其中約30%～60%的患者經(jīng)過(guò)數(shù)月或數(shù)年后可以轉(zhuǎn)變?yōu)榘籽?。按照不同病程情況MDS分為不同型別，筆者所在醫(yī)院血液腫瘤科收治了1例MDS-RAEBT患者，為了進(jìn)一步觀察和監(jiān)測(cè)患者的病情發(fā)展情況，筆者檢測(cè)并分析了其骨髓細(xì)胞中白血病相關(guān)融合基因的表達(dá)情況。

1 對(duì)象和方法

1.1 病例資料 患者，男，51歲，因原因不明發(fā)熱入院。體格檢查：體溫37.3°C，脈搏110次/min，呼吸18次/min，血壓115/75 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。 血液分析：WBC 4.7×109/L，Hb 67 g/L，HCT 0.19%，MCV1 00 fL，PLT 44×109/L。為查明貧血原因行骨髓檢查，細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示增生極度活躍伴原始粒系和淋巴細(xì)胞過(guò)多，初步診斷為MDS-RAEBT粒淋混合細(xì)胞型，轉(zhuǎn)入血液科繼續(xù)進(jìn)行治療。

1.2 材料和試劑 檢測(cè)材料為患者骨髓穿刺時(shí)取得的骨髓標(biāo)本。主要檢測(cè)試劑包括RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根生物技術(shù)公司），白血病融合基因檢測(cè)試劑盒（思爾成生物技術(shù)公司）等。

1.3 骨髓細(xì)胞學(xué)分析 抽出患者骨髓及時(shí)制備涂片標(biāo)本，標(biāo)本經(jīng)瑞氏-吉氏染色，鏡檢觀察并分析骨髓細(xì)胞特征。另選骨髓涂片做過(guò)氧化酶POX染色，通過(guò)鏡檢觀察細(xì)胞質(zhì)中過(guò)氧化酶的表達(dá)情況分析骨髓細(xì)胞類(lèi)型。

1.4 白血病相關(guān)融合基因的檢測(cè) 為確定患者骨髓中可能存在的分子遺傳學(xué)變異情況，筆者應(yīng)用多重巢式逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測(cè)了目前已知的融合基因的表達(dá)情況。

1.4.1 骨髓細(xì)胞mRNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 RNA的提取步驟按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行，將患者骨髓標(biāo)本，置于紅細(xì)胞裂解液中裂解紅細(xì)胞，離心除去上清，得到的白細(xì)胞沉淀用細(xì)胞裂解液裂解、過(guò)濾柱過(guò)濾后收集濾液，DEPC乙醇沉淀RNA，吸附柱吸附RAN沉淀，經(jīng)過(guò)去蛋白、脫DNA等純化步驟后，得到骨髓細(xì)胞 RNA。取 10ulRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后得cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增并電泳檢測(cè)白血病相關(guān)融合基因的表達(dá)情況，包括AML1-ETO、BCR-ABL、CBF-MYH、E2A-PBX、MLL-AF4、PML-RARα、SIL-TAL、TEL-AML等8類(lèi)白血病相關(guān)基因及其41種亞型。

1.4.2 多重巢式PCR檢測(cè)融合基因 以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，按照標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)融合基因。第一輪反應(yīng)條件為：95℃ 5min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 2min，共30個(gè)循環(huán)；4℃保存。第二輪反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min產(chǎn)物充分延伸；4℃保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外檢測(cè)儀檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 患者的骨髓細(xì)胞學(xué)特征 結(jié)合外周血片顯微鏡分析患者骨髓細(xì)胞特征，結(jié)果顯示骨髓增生極度活躍，并且伴原始幼稚粒系和幼稚淋巴細(xì)胞過(guò)多，血小板少見(jiàn)，可診斷為MDS-RAEBT粒淋混合細(xì)胞型，圖1示骨髓涂片中的幼稚粒系與幼稚淋巴細(xì)胞，分別可占片中骨髓細(xì)胞總數(shù)的26%與24%。

圖1 患者骨髓細(xì)胞涂片（10×100）

POX染色結(jié)果顯示幼淋巴細(xì)胞呈陰性表達(dá)，粒系細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，細(xì)胞胞漿中充滿(mǎn)粗大的藍(lán)黑色顆粒（圖2）。

圖2 過(guò)氧化物酶染色（10×40）

對(duì)骨髓中白血病融合基因的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AML1-ETO泳道有熒光信號(hào)，提示患者骨髓細(xì)胞中染色體斷裂形成的AML-ETO易位基因呈陽(yáng)性，圖3箭頭所示，圖3示從左向右的融合基因依次為T(mén)EL-AML、SIL-TAL、PML-RARα、MLL-AF4、E2A-PBX、CBF-MYH、AML1-ETO和BCR-ABL。

圖3 融合基因的RT-PCR檢測(cè)電泳圖

3 討 論

MDS的確切病因及其分子機(jī)制尚不明確，其誘因多樣，生物、化學(xué)或物理等因素均可引起染色體異常導(dǎo)致基因突變，從而使某個(gè)惡變的細(xì)胞克隆性增生，也可能只引起基因表達(dá)的改變導(dǎo)致MDS。由于MDS臨床表現(xiàn)較為復(fù)雜，而其向白血病轉(zhuǎn)化的過(guò)程中分子遺傳學(xué)改變的機(jī)制可能更為復(fù)雜。

研究發(fā)現(xiàn)在不同類(lèi)型的白血病中存在不同的分子標(biāo)記物。在急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）中存在特異性遺傳標(biāo)志為8號(hào)與21號(hào)染色體的長(zhǎng)臂在二區(qū)二帶斷裂并相互易位 [t（8；21）（q22；q22）]，AML1基因重排可作為診斷AML的分子標(biāo)志[1,2]。t（8；21）（q22；q22）使21號(hào)染色體上的AML1基因與8號(hào)染色體上的ETO基因發(fā)生融合，形成AML1-ETO融合基因，產(chǎn)生一種嵌合蛋白，作為主要的抑制物改變了正常AML1-CBF（核結(jié)合因子）β這種與造血干細(xì)胞分化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的生理功能[3,4]，同時(shí)在AML中還發(fā)現(xiàn)原始細(xì)胞CD34抗原表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度均高于正常的原始細(xì)胞[5]。此外研究還顯示，AML1-ETO易位基因見(jiàn)于10%的原發(fā)性AML，在M2型中的陽(yáng)性率可達(dá)50%，其中M2b中甚至達(dá)到90%。AML1-ETO陽(yáng)性的細(xì)胞有一定程度的分化能力，并且對(duì)化療反應(yīng)較為敏感，大劑量阿糖胞苷治療效果較好，具有較高的緩解率，預(yù)后較好，無(wú)病生存期長(zhǎng)[3]。

國(guó)內(nèi)有學(xué)者研究分析了AML1-ETO陽(yáng)性病例骨髓涂片,檢測(cè)到骨髓涂片中的異形中幼粒細(xì)胞與AML1-ETO基因陽(yáng)性表達(dá)存在關(guān)聯(lián)[6]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)兒童AML患者AML1-ETO融合基因陽(yáng)性不能提示形態(tài)學(xué)是否可診斷為M2b，AML1-ETO融合基因?qū)和疢2b沒(méi)有成人特異[7]。新近的研究還發(fā)現(xiàn)AML1-ETO融合基因與白血病TSC基因的轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)[8]。

關(guān)于MDS和白血病關(guān)系，已有的研究提示部分MDS最終可能會(huì)惡性轉(zhuǎn)化為白血病。本文患者骨髓細(xì)胞分析顯示MDS-RAEBT粒淋混合細(xì)胞型，但是卻表現(xiàn)為AML-ETO融合基因陽(yáng)性。由于染色體易位導(dǎo)致的AML-ETO融合基因目前認(rèn)為是AML的分子標(biāo)記物，這提示了在MDS的轉(zhuǎn)化過(guò)程中已經(jīng)發(fā)生染色體易位，導(dǎo)致了基因組不穩(wěn)定并產(chǎn)生異質(zhì)性細(xì)胞，提示可能在MDS向白血病轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，骨髓細(xì)胞由于某些因素作用使得染色體發(fā)生斷裂與重接，原來(lái)染色體上的正常功能基因發(fā)生改變，產(chǎn)生基因突變，形成了新的融合基因，而攜帶該突變基因的骨髓細(xì)胞克隆產(chǎn)生不正確的效應(yīng)分子，與后期的白血病發(fā)生密切相關(guān)，并使得發(fā)生白血病轉(zhuǎn)化的可能性大大增加。

對(duì)于AML型白血病，盡管存在局限性，但AML1-ETO融合基因仍然是目前發(fā)現(xiàn)的可靠的檢測(cè)標(biāo)記物，AML1-ETO融合基因在正常人體細(xì)胞中不存在，因而也可以作為白血病微小殘留病檢測(cè)的基礎(chǔ)。雖然目前對(duì)于MDS以及白血病的研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，但是對(duì)于MDS與白血病的進(jìn)展關(guān)系、分子水平的發(fā)病機(jī)制以及高效可靠的分子診斷標(biāo)記物的研究仍然需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。越來(lái)越多的研究證實(shí)現(xiàn)階段在臨床檢驗(yàn)中，對(duì)于MDS患者進(jìn)行融合基因的篩查對(duì)于指導(dǎo)疾病的診斷、治療和預(yù)后具有重要的意義[9,10]。

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