蛋白激酶C在肺缺血預(yù)處理保護(hù)中的作用

張郁林，黃燁，周波，楊衛(wèi)東，聶軍，李奎，萬(wàn)沛

(宜昌市第一人民醫(yī)院心胸外科，湖北宜昌 443002)

缺血預(yù)處理(ischemia preconditioning，IPC)是機(jī)體一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，已在動(dòng)物和臨床病人[1]中得到證實(shí)，但相關(guān)機(jī)制卻不明。大量研究證實(shí)，蛋白激酶C(PKC)參與心肌等[2]多種器官的IPC保護(hù)效應(yīng)，PKC是否參與肺IPC保護(hù)效應(yīng)目前還不能定論。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立在體單側(cè)肺原位缺血/再灌注(I/R)模型[3]，探討PKC在肺IPC保護(hù)中的作用，并探討IPC的可能保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型

大鼠以1%戊巴比妥鈉50 mg·kg－1腹腔麻醉，肌肉注射硫酸阿托品針劑0.2 ml，氣管插管后接小動(dòng)物呼吸機(jī)，通氣壓力為 10 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)，吸呼比為1∶2，頻率 70 次·min－1，潮氣量 10 ml，氧濃度100%。取右側(cè)臥位，經(jīng)左前側(cè)第5肋間開(kāi)胸，解剖出左肺門(mén)并留置阻斷帶。按 Sekido方法[4]復(fù)制在體大鼠肺I/R模型，即用結(jié)扎法完全阻斷左肺門(mén)一段時(shí)間后，恢復(fù)其血供和通氣，其間保持左肺濕潤(rùn)，肝素100 U經(jīng)陰莖背靜脈注射，予生理鹽水皮下注射0.5 ml·h－1。取左全肺組織分別送檢。

1.2 分組

雄性SD大鼠50只，體重200～400 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分5組。假手術(shù)(Sham)組(S組，n=10):左肺門(mén)游離后，不阻斷左肺門(mén)，觀(guān)察165 min后取左全肺;I/R組(n=10):左肺門(mén)游離后，觀(guān)察45 min，再阻斷左肺門(mén)60 min，后開(kāi)放再灌注60 min，再取左全肺;IPC組(n=10):左肺門(mén)游離后，阻斷左肺門(mén)5 min，松開(kāi)10 min，重復(fù)3次(即IPC 45 min)，以后同 I/R組;多黏菌素 B(polymyxin B，PMB)組(n=10):左肺門(mén)游離后觀(guān)察45 min，并在此時(shí)間內(nèi)經(jīng)尾靜脈注射PMB生理鹽水1 ml(PMB購(gòu)自古泰生物公司，批號(hào)0319，劑量為 2 mg·kg－1)，以后同I/R組;IPC+PMB組(n=10):左肺門(mén)游離后，在45 min的IPC過(guò)程中靜脈注射PMB生理鹽水液1 ml(PMB同上)，以后同I/R組。

1.3 肺組織超氧化物歧化酶活力及丙二醛含量的測(cè)定

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法:取肺組織勻漿液0.1 ml，加入反應(yīng)液后測(cè)定其在550 nm處的吸光度值，考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定法檢測(cè)肺組織勻漿液中蛋白濃度。丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測(cè)定采用巴比妥酸法:取肺組織勻漿液0.1 ml，加入反應(yīng)液后測(cè)定其在532 nm處的吸光度值，考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定法檢測(cè)肺組織勻漿液中蛋白濃度。

1.4 肺組織損傷定量評(píng)價(jià)

1.4.1 肺濕干重比(W/D)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)?zāi)┤∷蜋z后剩余肺組織稱(chēng)重為肺濕重，于70℃烘箱烤24 h后稱(chēng)重為肺干重，計(jì)算出W/D。

1.4.2 肺泡損傷數(shù)比值測(cè)定 肺組織多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，每個(gè)標(biāo)本5張切片，任取1張，光鏡下觀(guān)察10～15個(gè)視野(200倍)的肺泡總數(shù)，根據(jù)Murata方法[5]計(jì)算肺泡損傷數(shù)，即每個(gè)肺泡中細(xì)胞總數(shù)(白細(xì)胞或紅細(xì)胞)超過(guò)2個(gè)以上視為肺損傷，損傷的肺泡數(shù)與總的肺泡計(jì)數(shù)的比值為肺泡損傷數(shù)比值(injured alveoli rate)。

1.5 肺組織超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察

實(shí)驗(yàn)?zāi)?，每組取4例，在肺門(mén)橫切面取1 mm×1 mm×1 mm大小肺組織2～3塊，用2.5%戊二醛預(yù)固定，1%鋨酸后固定，常規(guī)脫水、包埋、超薄切片，常規(guī)染色，透射電鏡(荷蘭FEI Tecnai G212型)觀(guān)察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組SOD活力、MDA含量、W/D和肺泡損傷數(shù)比值之間的比較

與S組相比，I/R組SOD活力下降、MDA含量升高、W/D升高、肺泡損傷數(shù)比值升高(均P＜0.01);與I/R組比較，IPC組SOD活力升高、MDA含量降低、W/D降低、肺泡損傷數(shù)比值降低(均P＜0.01);與I/R組比較，PMB組和IPC+PMB組各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 肺組織病理學(xué)改變

I/R組、PMB組和IPC+PMB組肺組織損傷明顯，光鏡下見(jiàn)肺泡間隔增寬明顯，肺泡間隔的毛細(xì)血管以及肺間質(zhì)內(nèi)的小靜脈擴(kuò)張、充血。肺間質(zhì)和肺泡腔有較多炎癥細(xì)胞滲出。肺泡腔內(nèi)充滿(mǎn)均勻紅染的水腫液，并可見(jiàn)多數(shù)“心衰竭細(xì)胞”，其胞質(zhì)內(nèi)含粗大的黃褐色的含鐵血黃素顆粒。電鏡下可見(jiàn)肺泡腔內(nèi)有密集絮狀物滲出和大量血細(xì)胞，毛細(xì)血管及肺內(nèi)小血管內(nèi)血細(xì)胞密集、擠壓。血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞以及氣-血屏障結(jié)構(gòu)大致正常，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞數(shù)量減少，板層小體數(shù)量減少，多數(shù)空泡化，線(xiàn)粒體腫脹，部分微絨毛脫落。IPC組肺組織損傷較I/R組明顯減輕，S組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常。見(jiàn)圖1～3。

表1 各組SOD活力、MDA含量、W/D和肺泡損傷數(shù)比值之間的比較(±s，n=10)

表1 各組SOD活力、MDA含量、W/D和肺泡損傷數(shù)比值之間的比較(±s，n=10)

a與S組比，P＜0.01;b與I/R組比，P＜0.01;c與IPC組比，P＜0.01

組 別 SOD/U·mg－1·pro－1 MDA/nmol·mg－1·pro－1 W/D 肺泡損傷數(shù)比值26.644 4 ±6.216 2 I/R 組 1.710 6 ±0.100 5a 2.687 6 ±0.161 0a 6.147 8 ±0.119 1a 52.512 8 ±6.914 9a IPC 組 1.907 1 ±0.079 4b 2.154 8 ±0.058 9b 5.204 4 ±0.057 3b 27.151 7 ±4.812 6b PMB 組 1.670 2 ±0.104 6c 2.718 7 ±0.122 3c 6.064 9 ±0.127 1c 53.100 0 ±1.565 0c IPC+PMB 組 1.670 0 ±0.085 3c 2.653 1 ±0.149 1c 6.046 6 ±0.133 2c 53.483 1 ±2.200 4/%S 組 1.878 3 ±0.078 2 2.113 1 ±0.100 2 5.289 0 ±0.153 8 c

圖1 各組肺組織顯微鏡照片F(xiàn)ig 1 The microscope photographs of five groups，lung tissue

圖2 IPC對(duì)肺I/R的作用 ×5 000Fig 2 The effect of IPC on I/R injury of lung(×5 000)

3 討 論

IPC對(duì)組織器官I(mǎi)/R損傷有明顯的防治作用，IPC能夠啟動(dòng)機(jī)體的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。然而，迄今為止對(duì)IPC如何啟動(dòng)組織器官的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制知之甚少，對(duì)肺的IPC研究起步較晚。既往有“腺苷學(xué)說(shuō)”、“熱休克蛋白學(xué)說(shuō)”、“α1受體學(xué)說(shuō)”、“氧自由基學(xué)說(shuō)”等從不同方面描述IPC的可能機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，IPC能明顯減輕肺I/R時(shí)的氧化損傷，表現(xiàn)為肺組織SOD活力升高、MDA含量降低、肺濕干重比下降、肺泡損傷數(shù)比值下降以及病理形態(tài)學(xué)上的改善，這些結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]類(lèi)似。

已有的研究表明，IPC發(fā)揮作用首先引起一些活性物質(zhì)的釋放，如腺苷、緩激肽、兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ等，這些物質(zhì)能夠與其相應(yīng)受體結(jié)合，經(jīng)G蛋白耦聯(lián)激活細(xì)胞膜磷脂酶。活化的磷脂酶水解膜磷脂產(chǎn)生二酰甘油，與Ca2+協(xié)同作用使細(xì)胞內(nèi)的PKC移到細(xì)胞膜而被激活?；罨腜KC使相應(yīng)底物蛋白磷酸化而發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IPC使PKC活化后，可降低氧自由基水平，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng);應(yīng)用PKC抑制劑PMB后，IPC保護(hù)作用消失，IPC+PMB組各檢測(cè)指標(biāo)和病理學(xué)改變與I/R組無(wú)明顯差異;而單獨(dú)使用PMB時(shí)，PMB組各檢測(cè)指標(biāo)和病理學(xué)改變與I/R組也無(wú)明顯差異。這說(shuō)明PKC參與了肺IPC的保護(hù)作用。

PKC是一組廣泛分布的、具有單一肽鏈結(jié)構(gòu)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞肌醇磷脂信號(hào)通路上起關(guān)鍵作用，在細(xì)胞生長(zhǎng)功能上也發(fā)揮重要作用。它們參與激素釋放、DNA及蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞分泌、細(xì)胞增殖分化、肌肉收縮等生理過(guò)程。PKC可以促進(jìn)蛋白磷酸化是其介導(dǎo)IPC保護(hù)作用的基礎(chǔ)。許多內(nèi)源性物質(zhì)，如腺苷、緩激肽、兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ、氧自由基等具有與PKC偶聯(lián)的特點(diǎn)，可經(jīng)不同途徑激活PKC，活化的PKC作用于終末效應(yīng)子，如內(nèi)源性抗氧化酶、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、ATP敏感性鉀離子通道、熱休克蛋白等發(fā)揮保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，PKC可以促進(jìn)腺苷的合成[8]，后者具有廣泛的生物學(xué)活性，可通過(guò)延緩能量消耗、減少中性粒細(xì)胞激活、減少超氧陰離子產(chǎn)生、抑制血小板聚集、刺激糖酵解等起到內(nèi)源性保護(hù)作用。PKC還可以激活線(xiàn)粒體ATP敏感性鉀通道[9]，降低細(xì)胞內(nèi)鈣超載程度，維持鈣穩(wěn)態(tài)，減少ATP的消耗，參與抗氧化反應(yīng)。PKC還能激活絲裂原活化蛋白酶家族[10]，進(jìn)一步激活核轉(zhuǎn)錄因子，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄與蛋白合成，發(fā)揮保護(hù)作用，其可能機(jī)制為凋亡作用[11-12]、抗氧化、蛋白修復(fù)[13]、抑制白細(xì)胞黏附激活、擴(kuò)血管作用等。

目前發(fā)現(xiàn)PKC至少有12種同工酶亞型，分布在機(jī)體各組織細(xì)胞內(nèi)，而且各種亞型在不同組織中的分布是不同的。已證實(shí)并非所有的 PKC亞型都參與了心肌IPC的保護(hù)作用，可能只是某些亞型發(fā)生了轉(zhuǎn)位、激活。Armstrong等[14]使用選擇性δ、ε亞型PKC激動(dòng)劑ingenol預(yù)處理，可產(chǎn)生心肌保護(hù)作用，而選擇性α亞型PKC激動(dòng)劑thymeleatoxin預(yù)處理，沒(méi)有產(chǎn)生有效的心肌保護(hù)作用。PKC是否參與肺IPC保護(hù)效應(yīng)目前還無(wú)定論。對(duì)肺IPC保護(hù)效應(yīng)的研究，王萬(wàn)鐵等[15-16]發(fā)現(xiàn)，異丙酚、左旋精氨酸等通過(guò)上調(diào)肺組織PKC-α、δ、θ mRNA的表達(dá)，對(duì)肺I/R損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。另外，有報(bào)道[17-18]稱(chēng)，PKC-α 介導(dǎo)急性肺損傷，應(yīng)用PKC-α抑制劑對(duì)再灌注后肺組織具有一定的保護(hù)作用。因此，PKC在肺IPC保護(hù)中的作用機(jī)制還值得進(jìn)一步研究。

[1]FEATHERSTONE R L，CHAMBERS D J，KELLY F J.Ischemic preconditioning enhances recovery of isolated rat lungs after hypothermic preservation[J].Ann Thorac Surg，2000，69(1):237-242.

[2]何斌，王志農(nóng)，王軍，等.蛋白激酶C在心肌缺血預(yù)處理中的作用機(jī)制研究[J].中國(guó)體外循環(huán)雜志，2006，4(2):107-110.

[3]涂軍偉，徐正，王萬(wàn)鐵，等.蛋白激酶C在兔肺缺血預(yù)處理保護(hù)中的作用[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，33(2):89-91.

[4]SEKIDO N，MUKAIDA N，HARADA A，et al.Prevention of lung reperfusion injury in rabbits by a monoclonal antibody against interleukin-8[J].Nature，1993，365(6447):654-657.

[5]MURATA T，NAKAZAWA H，MORI I，et al.Reperfusion after a two hour period of pulmonary artery occlusion cause pulmo-nary necrosis[J].Am Rev Respir Dis，1992，146(4):1048-1053.

[6]羅萬(wàn)俊，陳勝喜，胡佳心，等.缺血預(yù)處理對(duì)肺再灌注損傷脂質(zhì)過(guò)氧化的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，1999，15(9):841-843.

[7]陳志新，曾因明，方志源.缺血預(yù)處理對(duì)離體大鼠缺血再灌注氧化損傷的影響[J].江蘇臨床醫(yī)學(xué)雜志，2002，6(5):392-394.

[8]要瑞莉，李宏杰.蛋白激酶C在缺血預(yù)適應(yīng)中的作用[J].中國(guó)城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生，2006，4:39-42.

[9]COSTA A D，GARLID K D，WEST I C，et al.Protein kinase G transmits the cardioprotective signal from cytosol to mitochondria[J].Cric Res，2005，97(97):329-336.

[10]何曉琴，吳黎明.蛋白激酶C及亞型與心肌缺血預(yù)處理及后處理[J].中國(guó)分子心臟病學(xué)雜志，2007，7(6):369-373.

[11]ZHANG X，BEDARD E L，POTTER R，et al.Mitogen-activated protein kinases regulate HO-1 gene transcription after ischemia-reperfusion lung injury[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2002，283(4):815-829.

[12]SAKIYAMA S，DEPERROT M，HAN B，et al.Ischemia-reperfusion decreases protein phosphorylation and p38 mitogen-activated protein kinase phosphorylation in rat lung transplants[J].J Heart Lung Transplant，2003，22(3):338-346.

[13]盧彥珍，王庸晉，王曉麗，等.蛋白激酶C對(duì)缺血預(yù)處理家兔心肌熱休克蛋白70mRNA的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2002，18(4):406-409.

[14]ARMSTRONG S C，GANOTE C E.Preconditioning of isolated rabbit cardiomyocytes:effects of glycolytic blockade，phorbol esters，and ischaemia[J].Cardiovasc Res，1994，28:1700-1706.

[15]王萬(wàn)鐵，林麗娜，涂軍偉，等.異丙酚對(duì)兔肺缺血-再灌注損傷時(shí)蛋白激酶C基因表達(dá)的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2005，21(3):545-548.

[16]王萬(wàn)鐵，王方巖，陳壽權(quán)，等.左旋精氨酸對(duì)兔肺缺血-再灌注損傷時(shí)蛋白激酶C基因表達(dá)的影響[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2006，15(12):1097-1101.

[17]柴軍，沈潔，吳秀英.七氟烷對(duì)缺血再灌注后大鼠肺組織PKC-α 表達(dá)的影響[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，38(5):357-359.

[18]王方巖，張曉隆，徐正祄，等.虎杖苷抗肺缺血再灌注損傷作用及對(duì)磷酸化蛋白激酶C-α調(diào)節(jié)的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)病理生理雜志，2008，24(2):384-387.