全腦照射后血腦屏障改變對放射性腦損傷的影響☆

阮林韋力廉春蓉張文佳莫立根李小妹

·論 著·

全腦照射后血腦屏障改變對放射性腦損傷的影響☆

阮林*韋力△廉春蓉△張文佳△莫立根※李小妹※

目的 探討全腦照射后血腦屏障通透性的改變對放射性腦損傷的影響。方法 80只昆明小鼠隨機分對照組、5 Gy、15 Gy和30 Gy劑量組，每組20只，分別于照射后1周和4周，各組隨機取出10只小鼠采用Morris水迷宮測試其空間記憶能力，行為測試結(jié)束后，隨機抽取7只測量其腦內(nèi)伊文思藍的含量，3只在電鏡下觀察血腦屏障結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果 照射后1周，15 Gy和30 Gy劑量組腦內(nèi)依文思藍明顯升高；照射后 4周，15 Gy劑量組恢復(fù)到對照組水平，而30 Gy劑量組仍未見恢復(fù)。照射后1周，15 Gy和30 Gy劑量組小鼠第1次穿越平臺的時間延長和穿越次數(shù)明顯減少；照射后4周，15 Gy劑量組恢復(fù)到對照組水平，而30 Gy劑量組仍未見恢復(fù)。電鏡結(jié)果顯示15 Gy劑量組照射后1周血腦屏障基膜周圍出現(xiàn)透亮區(qū)，照射后4周恢復(fù)；30 Gy劑量組照射后1周血腦屏障基膜周圍也出現(xiàn)透亮區(qū)，而照射后4周除血腦屏障基膜繼續(xù)透亮區(qū)外，尚出現(xiàn)內(nèi)皮細胞核固縮、神經(jīng)元凋亡和脫髓鞘等現(xiàn)象。結(jié)論 放射后血腦屏障的通透性的改變是放射損傷的結(jié)果，可能也是放射后繼發(fā)性腦損傷的原因。

放射性腦損傷 血腦屏障 伊文思藍 超微結(jié)構(gòu)

放射治療是治療鼻咽癌等頭頸部惡性腫瘤的有效手段，而放射性腦損傷 （radiation encephalophathy，REP）則是放射治療后嚴重的并發(fā)癥之一，其發(fā)病機制尚未清楚。有報道放射可以影響血腦屏障（blood brain barrier，BBB）通透性［1－2］。然而，放射后BBB通透性改變對REP影響如何，尚未明確，故本實驗通過觀察放射后小鼠BBB通透性及其學(xué)習(xí)記憶能力改變來探討放射后BBB在REP的發(fā)生和發(fā)展的作用，為有效防治放射性腦損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及動物模型的建立

1.1.1 實驗動物及分組 雄性昆明小鼠80只 （由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物機構(gòu)許可證號：SCXK桂2003－0003），2月齡，體質(zhì)量25～30 g。采取隨機化原則將小鼠分為對照組（0 Gy照射）、5 Gy劑量組、15 Gy劑量組和30 Gy劑量組共4組，每組20只，觀察時間分別為照射后1周和4周。晝夜交替環(huán)境下飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。

1.1.2 REP動物模型的建立 利用放療定位膜在65～70℃熱水中可軟化和冷卻后變硬的特點，按照小鼠的體型制作“放療定位膜固定罩”。照射前將小鼠俯臥于固定罩下，頭位固定，使小鼠不能轉(zhuǎn)動或移位，待60 Co對線對位后，制做鉛模，照射野上界位于雙眼后眥連線，下界位于雙耳后連線，避開口腔、鼻腔和雙眼。5、15和30 Gy劑量組小鼠分別予5 Gy、15 Gy和30 Gy照射，劑量率為1250 cGy·min－1，照射源與體表距離為80 cm。對照組固定后放于相似的條件下，但不予照射。

1.2 Morris水迷宮神經(jīng)行為學(xué)測試

1.2.1 水迷宮裝置（中國醫(yī)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供） Morris水迷由圓形水池、平臺以及記錄裝置三部分組成。水池用不銹鋼板制成，直徑1 m，高50 cm，厚3 mm。池壁上等距離標記東、南、西、北四個入水點，東西及南北兩點連線將水池等分為4個象限，分別稱SW、NW、SE及NE象限，將一個直徑為10 cm、高為28 cm的圓柱形平臺固定放置于SW象限的中心位置上，平臺頂部沒于水面下1 cm，水溫恒定，保持在（25±1）℃之間。池壁、池底及平臺均用黑色膠紙粘貼，水顏色染為黑色，以達到隱蔽平臺的目的。記錄分析裝置由攝像裝置（懸掛于水池正上方約2 m處）和電腦分析系統(tǒng)組成。測試期間，周圍環(huán)境以及水迷宮池壁上的參照物均保持不變，并保持室內(nèi)安靜。

1.2.2 測試過程 測試前1 d，為了減少應(yīng)激反應(yīng)對實驗結(jié)果的影響，各組實驗小鼠在學(xué)習(xí)訓(xùn)練前均被放逐于除去平臺的Morris水迷宮約1 min，以熟悉環(huán)境降低應(yīng)激反應(yīng)，適應(yīng)活動結(jié)束后將平臺放回原處。各組小鼠訓(xùn)練時間分3段進行：照射前1周，照射后第4、5、6 d及照射后第26、27、28 d，于每天上午9：00至下午17：00進行。每日的訓(xùn)練中，小鼠被連續(xù)測試4次，分別從東、南、西、北4個象限入水，入水時動物面向池壁，小鼠找到并爬上平臺后允許其在平臺上休息15 s，然后再進行下一次測試，如小鼠在60 s內(nèi)未能找到平臺則由實驗者將其引導(dǎo)到平臺上，休息15 s?？臻g記憶測試：分別于照射前1周，照射后1周和4周結(jié)束訓(xùn)練后第2 d進行，撤除平臺，NE象限為入水點將小鼠面向池壁放入水中，記錄其在120 s內(nèi)第1次穿過平臺位置的時間、穿越平臺的次數(shù)、游泳速度和空間探索策略（即游泳軌跡）。

1.3 腦組織EB測定

1.3.1 標準曲線制作 稱取4.0 mg伊文思藍于容量瓶中，加生理鹽水至總體積25 mL，取0.3 mL于試管中，加入5.7 mL甲酰胺混勻作為第1管，從第1管取3 mL加入3 mL甲酰胺作為第2管，從第2管取3 mL加入3 mL甲酰胺作為第3管，照此類共做 8管， 其濃度依次為 8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625（μg／mL）。置于37℃水浴箱72 h，以甲酰胺作為空白對照管，用722N可見分光光度計在EB最大吸收峰（620 nm）處測定各濃度（X值）EB溶液的吸光度（Y值），根據(jù)所測數(shù)值計算出回歸方程：Y＝－0.006＋20.134 X。

1.3.2 測試過程 于放射后1周和4周神經(jīng)行為測試結(jié)束后進行，各組隨機抽取7只小鼠，尾靜脈注射2%EB-NS（2 mg／kg）（sigma公司），存活3 h后，麻醉，經(jīng)心臟灌注生理鹽水直至流出清亮的液體為準。斷頭，冰盤取腦組織用電子天平精確稱其濕重后，放入盛有3 mL的甲酰胺的試管中，37℃水浴72 h，1500 r／min離心15 min，取上清液，用722 N可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）在EB最大吸收光譜620 nm處測吸光度，根據(jù)所測得的吸光度在繪制的標準曲線上查得EB濃度。代入下列公式，計算每克腦組織中EB的含量。腦組織EB含μg／g＝EB濃度（μg／mL）×3 mL（甲酰胺體積）／腦組織重量（g）。

1.4 電鏡觀察 于放射后1周和4周神經(jīng)行為測試結(jié)束后進行，各組隨機抽取3只小鼠，以3.5%水合氯醛（350 mg／kg）腹腔注射麻醉后，經(jīng)左心室主動脈先用生理鹽水50 mL快速沖洗，繼用2%多聚甲醛－2%戊二醛（pH 7.4）250 mL灌注固定，灌畢立即取腦浸于2%多聚甲醛－2%戊二醛（pH 7.4）中后固定4～6 h，在腦立體定位儀下取出小鼠前囟后3.54～4.54 mm側(cè)腦室背外側(cè)角處腦組織塊，按常規(guī)方法制備超薄切片，在H-500型透視電鏡（日本日立公司）觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，進行單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較用LSD法檢驗，以雙側(cè)α＝0.05為顯著性水準。

2 結(jié)果

2.1 空間探索性實驗 隨著訓(xùn)練次數(shù)增加，各組小鼠找到平臺時間越來越短，空間探索策略也由邊緣式轉(zhuǎn)向隨機式、趨向式和直線式，第一次穿越平臺的時間逐漸減少和穿越平臺的次數(shù)也逐漸增加（見表1、2和圖1、2）。此外，從表1、2和圖1、2尚可知，在照射前，各組小鼠空間探索策略、穿越平臺次數(shù)和第一次穿越平臺時間無明顯差別，但在照射后1周，與對照組相比，15 Gy和30 Gy劑量組小鼠不僅穿越平臺次數(shù)明顯也減少（P＜0.05），第1次穿越平臺時間明顯延長（P＜0.05），而且其空間探索策略也恢復(fù)為邊緣式或隨機式；照射后4周，15 Gy劑量組小鼠空間探索策略、穿越平臺次數(shù)和第1次穿越平臺時間恢復(fù)到對照組水平，但30 Gy劑量組小鼠空間探索策略仍為邊緣式或隨機式，并且第1次穿越平臺時間和穿越平臺的次數(shù)仍未見恢復(fù)到對照組水平。5 Gy劑量組小鼠僅見在照射后1周空間探索策略出現(xiàn)改變，其他觀察指標未見與對照組有明顯差別。在訓(xùn)練和測試等各階段，各組小鼠平均游泳速度無明顯差別（P＞0.05）。

2.2 腦組織伊文思藍含量的測試結(jié)果 各組小鼠腦組織EB含量的測定進行統(tǒng)計結(jié)果見表3。從表3可知，與對照組相比，照射后1周，15 Gy和30 Gy劑量組腦組織EB含量增加（P＜0.05），其中30 Gy劑量組增加更為明顯（P＜0.01）。照射后4周，除30 Gy劑量組腦組織EB含量明顯增多外，其余各組未見明顯改變（P＞0.05）。

表1 各組小鼠照射前、后第1次穿越平臺的時間（s）

表2 各組小鼠照射前后穿越平臺的次數(shù)

圖1 照射后1周各組游泳軌跡 對照組 （A），5 Gy劑量組（B），15 Gy劑量組（C），30 Gy劑量組（D）

圖2 照射后4周各組游泳軌跡 對照組 （A1），5 Gy劑量組（B1），15 Gy劑量組（C1），30 Gy劑量組（D1）

表3 照射后不同時期腦組織EB含量（μg／g）的比較

圖3 照射后1周各組小鼠血腦屏障變化 對照組（A），5 Gy劑量組（B），15 Gy劑量組（C），30 Gy劑量組（D）（4800×，bar＝1 μm）

圖4 照射后4周各組小鼠血腦屏障變化 對照組（A），5 Gy劑量組（B），15 Gy劑量組（C），30 Gy劑量組（D）（4800×，bar＝1 μm）

2.3 電鏡觀察結(jié)果 對照組毛細血管管腔規(guī)則、內(nèi)皮細胞形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整，厚度適中，內(nèi)皮細胞間有緊密連接，毛細血管基膜薄而均勻，基膜外有星形膠質(zhì)細胞足板圍繞，其胞質(zhì)染色均勻。照射后1周，5 Gy劑量組可見內(nèi)皮細胞胞質(zhì)內(nèi)吞飲小泡增多，15 Gy和30 Gy劑量組毛細血管形態(tài)不規(guī)則，厚薄不等，在基膜周圍出現(xiàn)透亮區(qū)（見圖3）；照射后4周，5 Gy和15 Gy劑量組的形態(tài)結(jié)構(gòu)恢復(fù)到對照組水平，而30 Gy劑量組形態(tài)結(jié)構(gòu)改變不僅沒有恢復(fù)，而且尚可見內(nèi)皮細胞核固縮，神經(jīng)元染色體濃縮或邊集，膠質(zhì)細胞腫脹和脫髓鞘等病理性改變（見圖4）。

3 討論

BBB是腦與血液及腦脊液之間的一種屏障，能控制血腦兩側(cè)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定起到重要作用。正常情況下，EB不能透過BBB，在腦損傷時BBB通透性增高，EB則可通過BBB，因此腦組織EB含量值越大提示BBB通透性越高。本課題采用EB作為示蹤劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15 Gy和30 Gy劑量照射后1周腦組織EB含量明顯高于對照組，同步電鏡下也觀察到其血腦屏障結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病理性改變，與文獻報道一致［1－2］，不僅提示放射對BBB功能有損傷作用，同時也提示放射對BBB結(jié)構(gòu)有損傷作用。學(xué)習(xí)記憶能力下降是放射性腦損傷最主要的臨床表現(xiàn)［3－4］，本課題組通過Morris水迷宮進行檢測放射后小鼠學(xué)習(xí)記憶能力等腦功能的改變，也印證上述觀點，即15 Gy和30 Gy劑量照射后1周小鼠穿越平臺次數(shù)下降和第一穿越平臺時間延長；然而照射后4周15 Gy學(xué)習(xí)記憶能力恢復(fù)到對照組水平，而30 Gy學(xué)習(xí)記憶能力仍出現(xiàn)進行性損傷。有報道BBB的破壞是引發(fā)一系列腦組織損傷的關(guān)鍵因素，是腦源性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一［5－6］。本課題組進一步研究發(fā)現(xiàn)，30 Gy劑量照射后4周，小鼠學(xué)習(xí)記憶力出現(xiàn)進行性損傷，其BBB結(jié)構(gòu)和功能也出現(xiàn)明顯損傷，而15 Gy劑量照射后4周，BBB結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)到對照組水平，空間記憶能力自行恢復(fù)到對照組水平，這結(jié)果不僅印證上述觀點，同時提示大劑量照射或小劑量的反復(fù)照射造成BBB持續(xù)開發(fā)或損失，可以造成放射后腦組織的繼發(fā)損傷，這較好解釋臨床上全腦放療后部分腦損傷能自行恢復(fù)，而有些為不可逆和進行性等［7－8］現(xiàn)象，但其機制有待進一步探討。無疑，放射后BBB開放既是放射損傷的結(jié)果，可能也是放射后腦組織繼發(fā)性損傷的原因。因而，若能減輕放療后BBB的損傷，有效地控制這一病理生理過程，對于放射性腦損傷的治療及預(yù)后可能有重要臨床意義。

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（責任編輯：李 立）

表1 酒精濫用大學(xué)生與對照組大學(xué)生TPQ緯度得分比較

據(jù)以往研究報道，高NS得分的個體常喜歡發(fā)展新興趣，從事新活動，但易忽略細節(jié)，很快分心，或感到無聊，因此易產(chǎn)生物質(zhì)濫用；HA反映了大腦的懲罰（或行為抑制）系統(tǒng)，低HA得分與青少年早期物質(zhì)使用和酗酒有關(guān)；RD反映了促進獲取條件化信號或獎賞或遠離懲罰的大腦系統(tǒng)的變動，低RD得分大學(xué)生對言語贊許和社會強化的反應(yīng)能力受損，且往往不能堅持某一行為，對現(xiàn)實生活中難以預(yù)測的挫折絲毫不能忍受。因此，習(xí)慣于使用物質(zhì)來發(fā)泄情緒［5］。本研究結(jié)果支持既往三維人格的理論假設(shè)，提示高NS分／低HA分和低RD得分的個體更易發(fā)生成癮行為，與臺灣學(xué)者的觀點一致，認為可對具有此類人格特點的具有家庭等其他風(fēng)險因素的青少年進行必要的防成癮干預(yù)［5］，這可能降低成癮行為的發(fā)生率。

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The study on the relationship between permeability alteration of blood brain barrier and radiation brain injury after whole brain irradiation in rats.

RUAN Lin，WEI Li，LIAN Chunrong，ZHANG Wenjia，MO Ligen，LI Xiaomei.Department of Radiotherapy of the First Affiliated Hospital，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China.Tel：0771－5358854.

Objective To observe the effects of the changes of blood brain-barrier on radiation encephalophathy after whole brain irradiation.Methods Eighty mice were randomly divided into 4 groups：control group，5Gy-irradiated group，15Gy-irradiated group and 30Gy-irradiated group（20 mice in each group）.The ability of space memory was tested by using Morris Water Maze in 1 week and 4 weeks after irradiation respectively.The BBB permeability was evaluated by measuring the Evans Blue（EB）content of the brain and the ultrastructural changes of BBB was investigated under transmission electron microscope.Results One week after irradiation，the levels of brain EB were significantly higher in 15 and 30 Gy dose groups than in control group.Four weeks later，the levels of brain EB returned to control levels in 15 Gy group but remained unchanged in 30 Gy group.Similarly，the time for first platform cross was prolonged and the number of platform cross was reduced in 15 and 30 Gy groups one week after irradiation.the time for first platform cross and the number of platform cross returned to normal in 15 Gy group but remained unchanged in 30 Gy group four weeks after irradiation.Electron microscopy showed the translucent zone around the basement membrane of BBB in 15 and 30 Gy groups.The translucent zone returned to normal in 15 Gy group but still remained accompanying with endothelial cell shrinkage，neuronal apoptosis and demyelination in 30 Gy group.Conclusions The alteration of BBB permeability after radiation change may result from primary radiation injury or may be the cause of secondary radiation-induced brain injury.

Radiation encephalophathy（REP） Blood-brain barrier（BBB） Evans Blue（EB） Ultrastructure

R743

A

2010－10－20）

R749.6 （

2011－07－20）【文獻標識碼】A （責任編輯：曹莉萍）

☆ 廣西青年基金項目（編號：0640038），廣西科學(xué)基金項目（編號：0342038）

* 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院放療科（南寧 530021）

△ 廣西醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室

（E-mail：wei＿lm＠yahoo.com.cn）

※ 廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院頭頸外科