3個單純型發(fā)作性運(yùn)動誘發(fā)性運(yùn)動障礙家系的致病基因定位

陳素琴王一鳴李洵樺梁秀齡周玨倩方瑩瑩

·論 著·

3個單純型發(fā)作性運(yùn)動誘發(fā)性運(yùn)動障礙家系的致病基因定位

陳素琴*王一鳴*李洵樺△梁秀齡△周玨倩△方瑩瑩△

目的 在3個中國漢族單純型發(fā)作性運(yùn)動誘發(fā)性運(yùn)動障礙 （paroxysmal kinesigenic dyskinesia，PKD）家系中確定其疾病基因所在區(qū)域。 方法 在已知的PKD連鎖區(qū)域 16p12.2-q22.3選取 14個微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記對37位家庭成員進(jìn)行基因分型，用Linkage和Genehunter等軟件進(jìn)行連鎖分析并構(gòu)建疾病單倍型。結(jié)果 連鎖分析及單倍型分析將致病基因定位于D16S3133～D16S3044（16p12.1-q12.1）之間11.2 cM的區(qū)域。結(jié)論 3個漢族單純型PKD家系的致病基因被定位于D16S3133～D16S3044（16p12.1-q12.1）之間，與最初的嬰兒驚厥及陣發(fā)性舞蹈手足徐動癥（infantile convulsions and paroxysmal choreoathetosis，ICCA）的位點(diǎn)重疊。

發(fā)作性運(yùn)動誘發(fā)性運(yùn)動障礙 基因定位 連鎖分析

發(fā)作性運(yùn)動誘發(fā)性運(yùn)動障礙 （paroxysmal kinesigenic dyskinesia，PKD，OMIN 128200）是發(fā)作性運(yùn)動障礙（paroxysmal dyskinesia）中最常見的一種，主要表現(xiàn)為突然運(yùn)動誘發(fā)的肌張力障礙、舞蹈、手足徐動等不自主運(yùn)動，發(fā)作持續(xù)時間一般不超過1 min，發(fā)作期間意識清醒，對抗驚厥藥物有良好的反應(yīng)［1］。PKD可以是散發(fā)性或家族性，后者多呈常染色體顯性遺傳，伴外顯不完全。PKD具有臨床表型異質(zhì)性。有些PKD患者伴有嬰兒驚厥、癲癇、偏頭痛或其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病。不伴有其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病者，稱之為“單純型PKD”。

PKD存在著遺傳異質(zhì)性，已報道的致病基因位點(diǎn)有 3個：位于 16p11.2-q12.1區(qū)域的 EKD1位點(diǎn)［2］，位于 16q13-q22.1區(qū)域的 EKD2位點(diǎn)［3］，以及可能位于 3q28-29的 EKD3位點(diǎn)［4］。其中，EKD1是最常見的 PKD致病基因位點(diǎn)，已有多個不同種族的PKD或嬰兒驚厥及發(fā)作性舞蹈手足徐動癥 （infantile convulsions and paroxysmal choreoathetosis，ICCA，OMIM 602066）和良性家族性嬰兒驚厥 （benign familial infantile convulsions，BFIC，OMIN 605751）家系定位于此［5－13］。目前3個位點(diǎn)的疾病基因均未被克隆。

我們收集到了3個常染色體顯性遺傳的單純型PKD家系，在覆蓋已知的EKD1和EKD2位點(diǎn)范圍選取14個微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記（marker）進(jìn)行基因分型，利用Linkage和Genehunter等軟件進(jìn)行參數(shù)和非參數(shù)連鎖分析，并構(gòu)建致病單倍型。

1 材料與方法

1.1 研究對象 3個中國漢族PKD家系，家系1（圖2A）和2（圖2B）來自廣東，家系3（圖2C）來自湖南。每個家系各有6例PKD患者，家系2中的Ⅱ：9和家系3中的Ⅲ：7為嬰幼兒起病的癲癇患者，但無PKD癥狀。所有PKD患者無合并癲癇及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病，為單純型PKD。3個家系總的男女患者病例為1∶1，遺傳方式為常染色體顯性遺傳。

患者發(fā)病年齡8～18歲，平均為10.8歲；表現(xiàn)為發(fā)作性一側(cè)或雙側(cè)的肢體、軀干、面部異常運(yùn)動，出現(xiàn)四肢舞蹈、手足徐動、顫搐、軀體扭轉(zhuǎn)等。發(fā)作程度不一，嚴(yán)重發(fā)作時四肢及面部異常活動致倒地，輕者僅感覺突然運(yùn)動時一側(cè)肢體瞬間的不自主運(yùn)動。女性癥狀多較男性為輕。發(fā)作時意識清醒。誘發(fā)因素多為突然運(yùn)動、用力、驚嚇等，以靜坐或久站后突然運(yùn)動誘發(fā)最為常見。發(fā)作持續(xù)時間，一般不超過1 min。發(fā)作頻率不定，可有一段時間不發(fā)作或一天發(fā)作數(shù)10次。發(fā)作間期正常。神經(jīng)系統(tǒng)檢查均未發(fā)現(xiàn)陽性體征。先證者頭顱CT或MRI檢查及腦電圖檢查未發(fā)現(xiàn)異常。所有患者均符合Bruno等［1］制定的PKD診斷標(biāo)準(zhǔn)。

我們對3個家系中的15例PKD患者及22名無PKD癥狀的家系成員，在獲得參與者的知情同意后，采集外周血，進(jìn)行遺傳學(xué)分析。

1.2 基因組DNA的提取 取外周靜脈血10 mL，EDTA抗凝，用QlAamp DNA Blood Maxi Kit（Qiagen，德國）抽提DNA，嚴(yán)格按照說明書操作。－70℃保存DNA。

1.3 基因型分析 選擇14個覆蓋PKD已知位點(diǎn) 16p11.2-q22.1的微衛(wèi)星標(biāo)記 （marker），包括D16S403，D16S3133，D16S3068，D16S3131，D16S3093，D16S3044，D16S3080，D16S3136，D16S419，D16S3034，D16S3140，D16S3057，D16S514和D16S3066。平均相鄰的Marker間距為3.0 cM，部分Marker來自ABI Linkage Mapping Set v2.5 HD5；部分由上海生工合成，合成的引物序列來自UCSC Genome Browser（http：／／genome.ucsc.edu／cgi-bin／hgGateway）。其中ABI Linkage Mapping Set v2.5 HD5的引物，其上游標(biāo)有FAM、VIC或NED不用顏色的熒光染料；而合成的引物，其上游標(biāo)有FAM熒光染料。PCR反應(yīng)在96孔微量板中進(jìn)行，10 μL反應(yīng)體系，采用Touchdown法，在ABI 9700PCR儀上完成。反應(yīng)條件為：95℃5 min；95℃30 s，64℃30 s，每個循環(huán)降低1℃，72℃45 s，10個循環(huán)；95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，25個循環(huán)。 PCR產(chǎn)物與去離子甲酰胺及GeneScanTM-500-LIZ按標(biāo)準(zhǔn)體系混勻后，95℃熱變性5 min，迅速置于冰塊上冷卻3 min，由ABI 3100基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離及數(shù)據(jù)收集。應(yīng)用GenesScan Analysis v3.7軟件進(jìn)行分子量內(nèi)標(biāo)GS-500校正，并自動將凝膠圖像轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號文件。采用Genotyper Software v2.1軟件將各泳道內(nèi)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行等位基因分型。

1.4 連鎖分析 根據(jù)家系成員每個位點(diǎn)的等位基因型，用Linkage軟件（Version 5.1）中的MLINK軟件進(jìn)行兩點(diǎn)連鎖關(guān)系分析［14］。參數(shù)設(shè)置如下：遺傳方式為常染色體顯性遺傳，外顯率分別設(shè)為0.9、0.8或0.7，疾病基因頻率為10－4，男女重組率相同。遺傳標(biāo)記的等位基因頻率設(shè)為1／n，其中n為3個家系中所觀察到的等位基因數(shù)目。利用FASTMAP軟件對兩點(diǎn)連鎖分析的數(shù)據(jù)進(jìn)行多點(diǎn)連鎖分析［15］，利用Genehunter軟件（Version 2.1）進(jìn)行多點(diǎn)參數(shù)與非參數(shù)連鎖分析［16］，其中遺傳標(biāo)記間的遺傳距離來自Marshfield，sex averaged，linkage map （http：／／research.marshfieldclinic.org／genet ics／GeneticResearch／compMaps.asp）。用HOMOG軟件進(jìn)行遺傳異質(zhì)性分析［17］。

1.5 單倍型的構(gòu)建 利用 Cyrillic 2.1軟件構(gòu)建單倍型，并按照家系中交換數(shù)最少的原則對單倍型進(jìn)行人工校正。分析單倍型與疾病狀態(tài)共分離的情況，確定所有患者共同攜帶的單倍型。

表1 不同外顯率下3個PKD家系總的兩點(diǎn)LOD值

2 結(jié)果

2.1 連鎖分析 在兩點(diǎn)連鎖分析中，3個家系總LOD值，在D16S3080處取得最大值，在外顯率為0.9，0.8，0.7，重組率θ＝0時分別為3.16，3.08和2.97。 總 LOD 值 大于 2.0的 另 一 Marker為D16S3068，在外顯率為0.9，0.8，0.7，重組率θ＝0時分別為2.83，2.69和2.53（表1）。根據(jù)LOD值的評判標(biāo)準(zhǔn)，支持D163080和D16S3068與致病基因存在連鎖；而且當(dāng)外顯率為0.9，0.8時，顯著支持D163080與致病基因存在連鎖。位于EDK2位點(diǎn)的Marker DS3140，D16S3057，D16S514和D16S3066在外顯率為0.9，0.8，0.7時LOD值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于－2，提示這些位點(diǎn)與致病基因不連鎖。

FASTMAP軟件的多點(diǎn)參數(shù)連鎖分析結(jié)果顯示，外顯率為0.9，0.8及0.7時，其最大LOD值均位于D16S3068～D16S3131之間 （未提供數(shù)據(jù)）。GENEHUNTER軟件的多點(diǎn)參數(shù)連鎖分析結(jié)果顯示，外顯率為0.9或0.8時，Marshfield圖譜中的59.68 cM處 （D16S3080位點(diǎn)）取得最大LOD值2.54或2.56（未提供數(shù)據(jù)）；外顯率為0.7時，最大LOD值2.75位于Marshfield圖譜中的D16S3068～D16S3131之間（圖1）。多點(diǎn)非參數(shù)連鎖分析結(jié)果顯示，NPL值在D16S3068～D16S3093之間取得最大NPL值3.85（p＝0.002）（圖1），根據(jù)Lander等提出的顯著性連鎖閾值為3.6的標(biāo)準(zhǔn)［18］，顯著支持致病基因與該區(qū)域連鎖。用HOMOG軟件進(jìn)行遺傳異質(zhì)性檢驗，未拒絕遺傳同質(zhì)性（未提供數(shù)據(jù)）。

2.2 單倍型分析 在上述14個Marker中，選取能夠提供重組交換信息的11個，構(gòu)建單倍型并進(jìn)行分析（圖2）。

圖1 當(dāng)外顯率為0.7時，11個微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記在3個PKD家系中的總的多點(diǎn)連鎖分析圖譜。 實(shí)的曲線表示參數(shù)連鎖分析的LOD值，虛的曲線表示非參數(shù)連鎖分析的NPL值，X軸上的數(shù)值表示Marshfield圖譜中的遺傳距離

圖2 PKD家系1～3的系譜及單倍型圖。11個微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記在單倍型圖的左側(cè)。 括號里的數(shù)字表示由雙親、同胞及子女推導(dǎo)得到的基因型。黑色柱狀圖表示疾病單倍型；白色柱狀圖表示正常單倍型；斜紋柱狀圖表示可能為疾病或正常單倍型。 右上角上的＋表示癲癇患者

家系-1的單倍型分析提示（圖2A），所有患者都攜帶有D16S3068～D16S3034間的3-2-3-1-3-1-2－3單倍型。Ⅲ：2，Ⅲ：3攜帶有該單倍型，Ⅱ：1攜帶有部分該單倍型，但無患病。

家系-2的單倍型分析提示（圖2B），Ⅲ：1發(fā)生了兩次重組。其中的一次重組發(fā)生在D16S3093和D16S3044之間。由于II-2的D16S419和D16S3034為等位基因的純合子，因而另一次重組有2種可能：可能發(fā)生D16S3136和D16S419間，也可能發(fā)生D16S3034和D16S3140之間。所有患者都攜帶有D16S3133～D16S3093間的3-1-2-2單倍型和／或D16S419～D16S3034間3-3單倍型。由于該家系的非參數(shù)連鎖分析的最大 NPL值 3.23位于D16S3133～D16S3093之間（未提供數(shù)據(jù)），并且3個家系總的最大NPL值3.85也位于該區(qū)域，故致病單倍型位于D16S3133～D16S3044之間。Ⅲ：3攜帶有 D16S3133～D16S3093間的 3-1-2-2單倍型，但無患病。

圖3 PKD、ICCA及BFIC在16號染色體區(qū)域的定位圖譜。各條直線對應(yīng)于不同的家系及定位區(qū)域。1：4個ICCA的法國家系［11］；2：1個ICCA的中國家系［12］；3：7個來自阿根廷和法國的BFIC家系［13］；4：8個日本PKD／IC家系［2］；5：1個非洲裔美國人PKD家系［5］；6：11個多種族的 PKD／IC家系［6］；7：1個西班牙 PKD家系［7］；8：7個日本PKD家系［8］；9：4個中國PKD家系［10］；10：1個印度家系的EKD2位點(diǎn)［4］；11為本研究中的3個PKD中國家系

家系3的單倍型分析提示 （圖2C），3例患者都攜帶有D16S403與D16S3140間的3-3-2-3-2-2-4-1-2-4-3單倍型。Ⅲ：7為癲癇患者，也攜帶有該單倍型，但無PKD癥狀。

在本研究中，3個家系中攜帶有致病單倍型的個體共有21例，有PKD表型的只有15例，外顯率為71.4%。故在連鎖分析時，外顯率設(shè)置為0.7比較合理。結(jié)合單倍型分析和連鎖分析結(jié)果，致病基因所在單倍型區(qū)域為 D16S3133～D16S3044間。

3 討論

PKD具有臨床表型和遺傳異質(zhì)性。有些PKD患者伴有嬰兒驚厥、癲癇、偏頭痛或其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病。由于基因定位于相同的區(qū)域，ICCA和BFIC被認(rèn)為與PKD是同一疾病的不同臨床表現(xiàn)。

家族性PKD多呈常染色體顯性遺傳，伴外顯不完全。目前為止，已報道的PKD致病基因位點(diǎn)有3個：位于16p11.2-q12.1區(qū)域的EKD1位點(diǎn)［2］，位于16q13-q22.1區(qū)域的EKD2位點(diǎn)［3］，以及可能位于3q28-29的EKD3位點(diǎn)［4］。其中，EKD1是最常見PKD致病基因位點(diǎn)，已有多個不同種族的PKD或ICCA或BFIC定位于此［2，5－13］（圖3）。

本研究中的3個家系符合常染色體顯性遺傳，且為不伴嬰兒驚厥、癲癇和偏頭痛等其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病，屬于單純型PKD。在兩點(diǎn)連鎖分析中，3個家系總的LOD值，在D16S3080處取得最大值2.97（在外顯率為0.7，重組率θ＝0時）；在外顯率為0.7，重組率θ＝0時D16S3068處的LOD值為2.53 （表1）。多點(diǎn)參數(shù)和非參數(shù)連鎖分析結(jié)果提示，最大的LOD值2.75和最大的NPL值3.85都位于D16S3068位點(diǎn)附近。單倍型分析時，家系2中的Ⅲ：1在研究區(qū)域內(nèi)發(fā)生了兩次重組交換，使最大致病基因所在區(qū)域大大縮窄，其中一次的重組位點(diǎn)有兩種可能：位于D16S3133～D16S3044之間，或位于D16S3136與D16S3140之間。而兩點(diǎn)連鎖分析、多點(diǎn)參數(shù)和非參數(shù)連鎖分析的結(jié)果均支持致病基因所在單倍型區(qū)域位于 D16S3133～D16S3044之間。

D16S3133～D16S3044區(qū)域 位于 16p12.1-q12.1，屬于EDK1位點(diǎn)。其Marshfield圖譜的遺傳圖距為11.52 cM，UCSC物理距離為22.7 Mb。該區(qū)域與已報道的PKD位點(diǎn)都有部分的重疊，但在16q端比目前已報道的位點(diǎn)［2，5－10，12－13］更靠近著絲粒（圖3）。該區(qū)域與1997年Szepetowski P等［11］報道的4個來自法國西北部的ICCA家系的致病基因所在區(qū)域D16S401～D16S517重疊。該4個家系的特點(diǎn)是：患者在3～12個月時出現(xiàn)無熱性嬰兒驚厥（infantile convulsion，IC），預(yù)后良好，使用抗驚厥藥后無復(fù)發(fā)；其后多數(shù)在5～19歲出現(xiàn)發(fā)作性舞蹈手足徐動癥，家系中大部分患者同時具有嬰兒驚厥和發(fā)作性舞蹈手足徐動癥癥狀。本研究的結(jié)果支持了ICCA與PKD可能是同一致病基因的不同臨床表現(xiàn)的觀點(diǎn)。

由于PKD外顯不完全，在參數(shù)連鎖分析中，不同的外顯率會影響分析結(jié)果。本研究中攜帶有致病單倍型的個體共有21例，有PKD表型的只有15例，外顯率為71.4%。外顯率取0.7時，本研究的多點(diǎn)非參數(shù)連鎖分析的最大NPL值與多點(diǎn)參數(shù)連鎖分析的最大LOD值及所在區(qū)域基本吻合。故外顯率設(shè)置為0.7時，連鎖分析的結(jié)果更有參考意義。

PKD的發(fā)病被認(rèn)為有性別差異。在8個日本PKD家系中，男女患病率為2∶1，男女外顯率的比例分別為0.94和0.74［2］。本研究中男女患者數(shù)目相同，但女性癥狀多較男性為輕，輕者僅感覺突然運(yùn)動時一側(cè)肢體瞬間的不自主運(yùn)動。這表明，可能存在一個性別依賴的修飾因子影響PKD突變基因的敏感性［2］。

PKD的病因及發(fā)病機(jī)制至今不清楚。有些學(xué)者認(rèn)為PKD是一種反射性癲癇［19］。PKD家系中癲癇患病率明顯高于一般人群，有報道PKD合并癲癇的發(fā)生率為8%［20］。本研究的3個家系中有2例嬰幼兒起病的癲癇患者，都不合并PKD，但其中一人（家系3的Ⅲ：7）攜帶有PKD的致病單倍型。該結(jié)果提示，PKD可能與癲癇有共同的發(fā)病基礎(chǔ)。也有學(xué)者認(rèn)為PKD源于基底節(jié)功能障礙［21］。雖然這些爭論還在繼續(xù)，但許多證據(jù)表明，PKD可能是一種離子通道?。?2］。而16號染色體性著絲粒區(qū)域有一基因簇編碼溶質(zhì)載體，包括 Na＋／Cl－、K＋／Cl－通道，Na＋／H＋和神經(jīng)遞質(zhì)通道，而且這些基因大多數(shù)位于ICCA及PKD區(qū)域。因此位于16號染色體著絲粒周圍區(qū)域編碼或控制離子通道功能的基因被認(rèn)為是PKD、ICCA和BFIC等候選基因［23］。目前已在一些 PKD家系中排除了部分候選基因［8，9，24］，甚至在一例ICCA患者中發(fā)現(xiàn)位于 16p11.2的 0.6 Mb的微缺失［25］。PKD致病基因區(qū)域的進(jìn)一步縮窄、致病基因區(qū)域（尤其是16p11.2微缺失區(qū)域）其他基因的克隆及對其他候選基因的突變篩查，有望找到PKD的致病性突變。PKD致病基因及基因功能的闡明將解開PKD臨床癥狀復(fù)雜多樣及遺傳異質(zhì)性之謎。

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Mapping of the gene responsible for pure paroxysmal kinesigenic dyskinesia in three Chinese Han families.

CHEN Suqin，WANG Yiming，LI Xunhua，LIANG Xiuling，ZHOU Jueqian，F(xiàn)ANG Yingying.Department of Neurology，the First Affiliated Hospital，Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510089，China.Tel：020－87755766.

Objective To map the gene responsible for pure paroxysmal kinesigenic dyskinesia in three Chinese Han families.Methods Fourteen microsatellite markers flanking 16p12.2-q22.3 were selected for genotyping in 37 family members.Parameter and non-parameter analysis were performed using Linkage and Genehunter softwares and haplotypes were constructed.Results A maximum two-lod score 2.97 at D16S3080 （θ＝0） and 2.53 at D16S3068（θ＝0）were obtained when penetrance set to 0.7.A maximum multi-lod score 2.75 and maximum NPL score 3.85（P＝0.002） were obtained at D16S3068～D16S3131.Haplotype analysis localized PKD to the region D16S3133～D16S3044（16p12.1-q12.1）.Conclusions The gene responsible for PKD in three Chinese Han families was mapped to 16p12.1-q12.1， which was the same as the original ICCA （infantile convulsions and paroxysmal choreoathetosis）region.

Paroxysmal kinesigenic dyskinesia Gene mapping Linkage analysis

R744

A

2010－10－09）

（責(zé)任編輯：李 立）

☆ 國家自然科學(xué)基金項目（編號：30671154）

* 中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室

（E-mail：lxunh＠yahoo.com.cn）

△ 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科