向陽王慶松鄭宇
·論 著·
反復(fù)驚厥閾下癇樣放電致大鼠持續(xù)性情緒喚醒障礙☆
向陽*王慶松*鄭宇△
目的 探討反復(fù)驚厥閾下癇樣放電是否可引發(fā)實(shí)驗(yàn)大鼠較長時(shí)間的情緒喚醒障礙。方法 選擇6~7周齡雄性SD大鼠62只,成組設(shè)計(jì),隨機(jī)分為驚厥閾下癇樣放電組 (subclinical epileptifor mdis charges group,SED組,n=16)、海馬快速電點(diǎn)燃組(hippocampal kindling group,HK組,n=16)、海馬電極埋植對照組(control of electrode group,EC組,n=15)、正常對照組(normal control group,NC組,n=15),建立大鼠反復(fù)SED動物模型,通過運(yùn)動活性、探究行為、拒俘反應(yīng)性、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn),觀測電刺激停止后1、7和30 d時(shí)實(shí)驗(yàn)大鼠情緒喚醒水平改變。結(jié)果 與EC組相比,電刺激后7 d,HK組、SED組大鼠曠場爬越行為明顯減少 (P<0.01),后肢性站立、進(jìn)入高架十字迷宮開臂次數(shù)百分比和滯留時(shí)間百分比降低(P<0.05),電刺激后30 d上述差異仍存在(P<0.05),同時(shí),HK組、SED組大鼠拒俘反應(yīng)性在電刺激后30 d有明顯增加(P<0.01)。結(jié)論 反復(fù)驚厥閾下癇樣放電引起了實(shí)驗(yàn)大鼠持續(xù)性運(yùn)動活性減少、探究行為受抑、警覺水平過高、焦慮不安狀態(tài)、環(huán)境適應(yīng)能力下降、驚恐逃避反應(yīng)等多種情緒喚醒障礙。
反復(fù)驚厥閾下癇樣放電 癲癇 持續(xù)性情緒喚醒障礙
癲癇所致認(rèn)知功能受損與情感行為障礙成為嚴(yán)重影響患者臨床診治和預(yù)后的重要因素之一。近年來,隨著對沒有明顯癇性發(fā)作的腦電圖癇樣放電現(xiàn)象,即臨床下癇樣放電(subclinical epileptiform discharges,SEDs)或發(fā)作間癇樣放電(interictal epileptiform discharges),對認(rèn)知功能影響的臨床研究,加深了我們對癲癇性精神障礙的認(rèn)識[1-2]。我們在前期工作中對短期內(nèi)驚厥閾下癇樣放電引起的情感行為障礙進(jìn)行了初步研究[3-4],但由于缺乏理想的動物實(shí)驗(yàn)?zāi)P停L時(shí)間反復(fù)驚厥閾下癇樣放電是否可引發(fā)更為持久的認(rèn)知及情感行為障礙目前仍不明確。為此,本研究在前期工作的基礎(chǔ)上,建立起既可較長時(shí)間誘發(fā)癇樣腦電發(fā)放、又無明顯驚厥行為的大鼠驚厥閾下癇樣放電(subconvulsive epileptiform discharges,SED)動物模型,并重點(diǎn)觀察了反復(fù)驚厥閾下癇樣放電(rSED)對實(shí)驗(yàn)動物情感行為的影響。
1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 6~7周齡健康雄性SD大鼠62只(第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供),實(shí)驗(yàn)起始體質(zhì)量180~230 g,12 h光亮/黑暗條件、22~25℃環(huán)境溫度,分隔喂養(yǎng)。將大鼠隨機(jī)分為4組,驚厥閾下癇樣放電組(SED組,n=16)、海馬快速電點(diǎn)燃組(hippocampal kindling group,HK組,n=16)、海馬電極埋植對照組 (electrode control group,EC組,n=15)及正常對照組(normal control group,NC組,n=15)。SED、HK、EC組大鼠分別適應(yīng)1周后開始做手術(shù)植入電極。造模過程中出現(xiàn)死亡或不符合模型要求者,予以剔除并隨機(jī)補(bǔ)充,保證每組動物數(shù)量。
1.2 模型制備
1.2.1 電極包埋與固定 參考文獻(xiàn)[4]的辦法制備海馬電刺激模型:大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后,固定在立體定位儀(NARISHIGE,Japan)上,沿中線切開頭皮并將肌肉等組織向兩側(cè)剝離后暴露出顱骨,清理干凈顱骨表面,待干燥后確定電極植入點(diǎn)。按大鼠腦圖譜[5]確定海馬CA1區(qū)電極埋植部位:記錄電極(單股鎳鉻合金電極,直徑0.2 mm):前囟前2.5 mm、旁開2.0 mm,及前囟后5.0 mm、旁開3.5 mm處鉆穿顱骨,插入5.0 mm電極作為記錄用引導(dǎo)電極。刺激電極(雙股直徑0.2 mm鎳鉻合金漆包線旋扭一起而成,尖距0.1 mm,實(shí)驗(yàn)前用萬用電表和生理鹽水檢查電極的絕緣性):前囟后4.2 mm,中線旁2.0 mm,深2.0 mm。用小型牙鉆(307-2型,上海醫(yī)療器械廠)鉆透顱骨,埋藏電極。各電極用牙托粉固定。術(shù)后觀察1 h,動物活動正常后即放回原飼養(yǎng)籠內(nèi),允許術(shù)后恢復(fù)1周。實(shí)驗(yàn)過程中,HK、SED組分別各有1只動物因電極脫落而被剔除試驗(yàn)。
1.2.2 電刺激參數(shù) 采用SEN-3201電子刺激器(NIHON KOHDEN,Japan)進(jìn)行電刺激。海馬快速電點(diǎn)燃按Bengzon等[6]的方法稍加改進(jìn):波寬1 ms、頻率16 Hz、串長10 s、刺激強(qiáng)度0.5 mA、串隔5 min,恒流、單向方波,平均刺激40次。海馬閾下刺激組采用我們前期實(shí)驗(yàn)[7]的刺激參數(shù):頻率30 Hz、波寬1 ms、串長10 s、刺激強(qiáng)度0.1 mA,每天刺激10次,串隔5 min,連續(xù)刺激4 d,恒流、單向方波。
1.2.3 皮層腦電圖(electrocorticogram,ECoG)記錄采用6200四導(dǎo)生理記錄儀(成都儀器廠)記錄。實(shí)驗(yàn)前記錄1 min,實(shí)驗(yàn)后先連續(xù)記錄15 min,然后每隔5 min記錄1 min,共記錄60 min。以后每次實(shí)驗(yàn)前均記錄5 min,ECoG確認(rèn)存在癇樣放電后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn),直至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。
1.2.4 癲癇發(fā)作分級參照Racine的標(biāo)準(zhǔn)[8]0級:腦電圖記錄有發(fā)作波形,而沒有抽搐動作;Ⅰ級:面肌抽動,咀嚼;Ⅱ級:節(jié)律性點(diǎn)頭;Ⅲ級:一側(cè)前肢陣攣;Ⅳ級:站立并雙前肢陣攣;Ⅴ級:持續(xù)站立和跌倒。
1.3 情感行為與空間學(xué)習(xí)記憶能力觀察
1.3.1 情感行為觀察 于電刺激后1、7和30 d時(shí)分別取每組大鼠各5只,觀察其情感行為改變:①大鼠運(yùn)動活性:將大鼠輕輕放入曠場行為觀察箱(按文獻(xiàn)[9-10]自制,60 cm×60 cm×60 cm的無頂木盒,箱底用墨線分為36個(gè)等份小方格)中央小方格內(nèi),觀測5 min內(nèi)動物的活動情況。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn):大鼠1/2以上身體從所在方格進(jìn)入相鄰方格,即爬越1次計(jì)1分,所得總分用于評價(jià)其運(yùn)動活性改變[9];②探究行為:方法同上,觀察5 min內(nèi)大鼠后肢性站立計(jì)分改變。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn):后肢性站立1次計(jì)1分,總分用于評價(jià)其探究行為改變[9];③拒俘反應(yīng)性:以動物從未接觸過的手套輕抓大鼠,觀察其反應(yīng)。記分標(biāo)準(zhǔn):0:很容易抓取動物;1:尖叫或回避;2:尖叫并回避;3:逃脫;4:逃脫并尖叫;5:咬或試圖撕咬手套;6:主動躍起攻擊,以此評價(jià)動物恐懼與沖突素質(zhì)特征改變[10];④高架十字迷宮(按文獻(xiàn)[11]制備,木質(zhì)結(jié)構(gòu),包括 2個(gè) 50 cm×10 cm的相對開臂和2個(gè)50 cm×10 cm×40 cm的相對閉臂,閉臂的上部敞開,迷宮中央有10 cm×10 cm的開闊部,迷宮離地面50 cm)實(shí)驗(yàn):將大鼠置于迷宮中央,頭朝閉臂。分別記錄5 min內(nèi)大鼠進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)和在兩臂滯留時(shí)間 (以四肢全部入臂或出臂為準(zhǔn)),計(jì)算大鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)和在開臂滯留時(shí)間分別占總次數(shù) (進(jìn)入開臂與閉臂次數(shù)之和)及總時(shí)間(在開臂與閉臂滯留時(shí)間之和)的百分比,以此為評價(jià)焦慮指標(biāo)[11]。
1.3.2 主要觀察指標(biāo) 大鼠爬越行為、后肢性站立、拒俘反應(yīng)性、高架十字迷宮開臂次數(shù)與開臂時(shí)間。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Matlab6.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料均以(±s)表示。各組比較采用單因素方差分析進(jìn)行,同一時(shí)間各組間方差齊性采用Bartlett檢驗(yàn),同一時(shí)間點(diǎn)不同組間兩兩比較用SNK法(用于方差齊性的大鼠爬越行為、拒俘反應(yīng)及開臂次數(shù)百分比的比較)和Tamhane’s T2法(用于方差不齊性的大鼠后肢性站立、開臂時(shí)間百分比的比較)進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
2.1 皮層腦電圖變化 正常大鼠海馬腦電以5~10 Hz的α波為主要表現(xiàn),無明顯陣發(fā)性節(jié)律出現(xiàn),波幅<100 mV(圖1)。海馬電極埋植后動物腦電活動無明顯變化(圖2)。HK組大鼠在癇性發(fā)作時(shí)出現(xiàn)明顯的陣發(fā)性長時(shí)程高波幅多棘波或多棘慢波(圖3)。SED組大鼠在刺激后即可記錄到較多的單發(fā)或連續(xù)的高波幅尖波、棘波、棘慢波。隨著時(shí)間推移,癇樣放電逐漸減少,1月后仍可記錄到反復(fù)出現(xiàn)的發(fā)作性棘、尖、慢波活動(圖4)。
2.2 驚厥行為觀察 NC組和EC組大鼠無驚厥樣表現(xiàn)。HK組大鼠在電刺激5~16次后出現(xiàn)活動逐漸減少,伴有“濕犬樣”抖動及撓頭動作,再經(jīng)歷4~9次電刺激后開始出現(xiàn)下頜快速咬動或顏面肌抽搐,隨后很快出現(xiàn)發(fā)作性四肢及全身強(qiáng)直,四肢直立,最后跌倒。刺激停止1 h后發(fā)作基本停止。整個(gè)發(fā)作以強(qiáng)直、陣攣表現(xiàn)為主。根據(jù)Racine的標(biāo)準(zhǔn)[8],HK組大鼠的發(fā)作表現(xiàn)均已達(dá)到Ⅲ~Ⅴ級。SED組大鼠在電刺激過程中可觀察到先出現(xiàn)活動減少,之后逐漸表現(xiàn)出一定的興奮性,修飾行為或“洗臉”行為增多,但未觀察到Ⅰ級以上(含Ⅰ級)驚厥發(fā)作。
2.3 大鼠電刺激后不同時(shí)間情感行為觀察結(jié)果
圖1 NC組大鼠ECoG記錄
圖2 EC組大鼠ECoG記錄
圖3 HK組大鼠ECoG記錄(電刺激后驚厥發(fā)作時(shí))
圖4 SED組大鼠ECoG記錄(電刺激后30 d)
表1 四組大鼠的爬越行為計(jì)分改變
表2 四組大鼠礦場實(shí)驗(yàn)中的站立次數(shù)
表3 四組大鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)/總次數(shù)
2.3.1 大鼠電刺激后不同時(shí)間曠場行為改變和高架十字迷宮行為改變結(jié)果 表1顯示,SED組、HK組大鼠電刺激后1 d內(nèi)曠場爬越行為明顯減少,顯示其運(yùn)動活性降低,至30 d時(shí)上述差異仍非常明顯;表2顯示,電刺激后1 d及7 d時(shí)HK組、SED組大鼠后肢性站立顯著減少,表明其探究行為明顯降低,至30 d時(shí)雖有所恢復(fù),但仍存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;表3、表4顯示,電刺激后1 d及7 d,HK組、SED組大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時(shí)間百分比均降低,電刺激后30 d,上述兩組實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比仍降低,進(jìn)入開臂滯留時(shí)間百分比僅較EC組存在差異,但P值已經(jīng)接近0.05。
2.3.2 大鼠捕食應(yīng)激后不同時(shí)間拒俘反應(yīng)性結(jié)果表5顯示,HK組、SED組大鼠拒俘反應(yīng)性在電刺激后1、7及30 d時(shí)均明顯增強(qiáng)。
表4 四組大鼠進(jìn)入開臂滯留時(shí)間/總時(shí)間
表5 四組大鼠的拒俘反應(yīng)性
在前期研究中證實(shí)發(fā)作間癇樣放電確實(shí)可引發(fā)實(shí)驗(yàn)動物短暫學(xué)習(xí)和記憶能力受損,同時(shí)亦觀察到SED還可引發(fā)實(shí)驗(yàn)動物程度更明顯、持續(xù)時(shí)間更長的活動習(xí)性改變、警覺水平增高、焦慮不安狀態(tài)、環(huán)境適應(yīng)能力下降等情緒喚醒障礙[3-4]。鑒于前期研究中的動物模型癇樣放電持續(xù)時(shí)間較短,放電頻率少,因此我們通過調(diào)整電刺激波寬、頻率、串長、刺激強(qiáng)度、串隔與刺激總次數(shù),使SED組大鼠在電刺激停止后1月內(nèi)均能記錄到反復(fù)發(fā)放的高幅棘、尖、慢波等癇樣腦電活動,且無明顯的驚厥行為,為進(jìn)一步探討反復(fù)驚厥閾下電刺激(rSED)對情緒喚醒水平的影響提供了理想的實(shí)驗(yàn)動物模型。
曠場實(shí)驗(yàn)是經(jīng)典的行為學(xué)實(shí)驗(yàn),能很好的評定動物的情緒性水平以及在開放的陌生環(huán)境中的探究行為,可用來測試動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的“興奮”或“抑制”狀態(tài),是檢測實(shí)驗(yàn)動物情緒喚醒水平的一種重要方法[9-10]。中央格停留時(shí)間是動物對環(huán)境適應(yīng)能力的反映,如果對新環(huán)境的適應(yīng)能力差,則大鼠停留在中央格的時(shí)間延長。爬越次數(shù)則代表大鼠的興奮性狀態(tài)。動物初入陌生環(huán)境可出現(xiàn)明顯的防護(hù)性情感反應(yīng),表現(xiàn)為迅速離開中央格,沿周邊活動,這對于量化分析實(shí)驗(yàn)動物的警覺水平、焦灼狀態(tài)、環(huán)境適應(yīng)能力等有重要意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SED組大鼠電刺激后1、7和30 d內(nèi)曠場爬越行為明顯減少,提示其新環(huán)境中運(yùn)動活性顯著降低;拒俘反應(yīng)性同步顯著增強(qiáng),顯示其受驚嚇程度嚴(yán)重、沖突特性增強(qiáng)、易激惹、掙扎行為明顯;電刺激后1 d及7 d時(shí)后肢性站立減少,30 d仍減少,表明其挫折感明顯、探究行為顯著受抑。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見,反復(fù)SED可致實(shí)驗(yàn)大鼠在新環(huán)境中的警覺水平明顯增高、易激惹、適應(yīng)能力顯著下降,在刺激后較長時(shí)間內(nèi)一直處于驚恐逃避情感反應(yīng)中。
高架十字迷宮試驗(yàn)則是以動物自發(fā)行為為基礎(chǔ),利用動物對新異環(huán)境的探究特性,以及對高懸敞開臂的恐懼感而形成的矛盾沖突狀態(tài)來評價(jià)實(shí)驗(yàn)動物焦慮素質(zhì)特征的[11],其通過進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時(shí)間百分比反映動物的焦慮狀態(tài),焦慮動物上述指標(biāo)均明顯降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,電刺激后1 d及7 d,實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時(shí)間百分比均降低,電刺激后30 d,實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比仍降低,提示反復(fù)SED對大鼠有明顯的長時(shí)間的致焦慮效應(yīng)。雖然,電刺激后30 dHK組、SED組大鼠進(jìn)入開臂時(shí)間百分比較EC組仍存在差異,可以說明反復(fù)驚厥閾下癇樣放電對實(shí)驗(yàn)動物焦慮情緒仍存在持續(xù)性影響,但差異已經(jīng)非常微?。≒值已接近0.05),同時(shí)HK組、SED組大鼠較NC組已經(jīng)無差異,是否說明電極本身對實(shí)驗(yàn)大鼠的影響和癇樣放電對實(shí)驗(yàn)大鼠的影響產(chǎn)生了“拮抗”作用,尚需進(jìn)一步觀察和討論。
通過海馬反復(fù)驚厥閾下電刺激,成功誘發(fā)了實(shí)驗(yàn)動物明顯而持續(xù)的運(yùn)動活性減少、探究行為受抑、警覺水平過高、焦慮不安狀態(tài)、環(huán)境適應(yīng)能力下降、驚恐逃避反應(yīng)等多種情緒喚醒障礙。因此,反復(fù)SED可能引發(fā)包括抑郁、焦慮等更為持久的情感行為異常與社會適應(yīng)能力下降。反過來我們有理由推測,對于抑郁癥、焦慮癥等臨床患者,無明顯癇性發(fā)作表現(xiàn)的SED現(xiàn)象亦可能是部分患者的重要發(fā)病原因之一。但對反復(fù)SED的直接作用能引起何種神經(jīng)生物學(xué)改變尚并不明確,亟待進(jìn)一步探討。
[1]Aldenkamp AP,Beitler J,Arends J,et al.Acute effects of subclinical epileptiform EEG discharges on cognitive activation[J].Funct Neurol,2005,20(1):23-28.
[2]Holmes GL,Lenck-Santini PP.Role of interictal epileptiform abnormalities in cognitive impairment[J].Epilepsy Behav,2006,8(3):504-515.
[3] 王慶松,張汝,楊仕柏.發(fā)作間癇樣放電對大鼠情感行為及空間學(xué)習(xí)記憶的影響[J].中華神經(jīng)科雜志,2002,35(1):36-39.
[4]Wang QS,Wang ZG.Effects of subconvulsive electrical stimulation to the hippocampus on emotionality and spatial learning and memory in rats[J].Chin Med J,2003,116(9):1361-1365.
[5] 包新民,舒斯云.鼠腦立體定位圖譜[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1991:12.
[6]Bengzon J,Kokaia M,Brundin P,et al.Seizure suppression in kindling epilepsy by intrahippocampallocus coeruleus grafts: evidence for an alphaadrenoreceptor mediated mechanism[J].Exp Brain Res,1990,81(2):433-437.
[7] 向陽,王慶松,鄭宇.反復(fù)驚厥閾下癇樣放電致海馬齒狀回顆粒細(xì)胞樹突改變[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2009,35(4):223-227.
[8]Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation.Ⅱ.Motor seizure[J].Electroencephalogr Clin Neurophysiol,1972,32(3):281-294.
[9]Page GG,Blakely WP,Kim M.The impact of early repeated pain experiences on stress responsiveness and emotionality at maturity in rats[J].Brain Behav Immun,2005,19(1):78-87.
[10]Young NA,Wintink AJ,Kalynchuk LE.Environmental enrichment facilitates amygdala kindling but reduces kindling-induced fear in male rats[J].Behav Neurosci,2004,118(5):1128-1133.
[11]Doremus TL,Varlinskaya EI,Sppear LP.Age-related differences in elevated plus maze behavior between adolescent and adult rats[J].Ann N Y Acad Sci,2004,1021:427-430.
(責(zé)任編輯:李立)
Recurrent subconvulsive epileptiform discharges facilitate persistent emotionality disorder in rats.
XIANGYang,WANG Qingsong,ZHENG Yu.Department of Neurology,Chengdu General Hospital of Chengdu Military Area Command of Chinese PLA,Chengdu 610083,China.Tel:028-86570712.
Objective To investigate whether or not recurrent subconvulsive epileptiform discharges may facilitate the persistent emotionality disorder in rats.Methods Sixty-two male SD rats aged from 6 to 7 weeks old were selected and divided randomly into 4 groups: SED group(n=16)for rats with recurrent subconvulsive epileptiform discharges,HK group(n=16)for hippocampal kindling,EC group(n=15)for control of electrode,NC group(n=15)for normal control.The changes in emotionality of experimental rats were tested by locomotor activity,exploratory behavior,capture-resistance and elevated plus-maze(EPM)test at 1,7,30 d after electrical stimulations.Results Compared with the EC group, at 7 d after electrical stimulation,rats in the HK,SED group displayed a significantly decrease in number of creeping(P<0.01),and the standing on hind limbs,the percentages of open-arm entries and open-arm retention time in EPM test was decresed(P<0.05),and the difference still existed at 30 day after electrical stimulation(P<0.05).And the capture-resistance in rats in the HK,SED group was significantly increased at 30 day after electrical stimulation(P<0.01). Conclusions Recurrent subconvulsive epileptiform discharges causes the persistent emotionality as decreased locomotor activities,suppressed exploratory behavior,enhanced startle,delayed habituation,increased anxiety and defense reaction.
Recurrent subconvulsive epileptiform discharges(rSED) Epilepsy Persistent emotionality disorder
R742.1
A
2011-03-14)
☆ 四川省衛(wèi)生廳科研課題(編號:070389)
* 成都軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(成都 610083)
△ 成都軍區(qū)總醫(yī)院腎臟內(nèi)科
(E-mail:wqs832001@sina.com)