反復(fù)驚厥閾下癇樣放電致大鼠持續(xù)性情緒喚醒障礙☆

向陽王慶松鄭宇

·論 著·

反復(fù)驚厥閾下癇樣放電致大鼠持續(xù)性情緒喚醒障礙☆

向陽*王慶松*鄭宇△

目的 探討反復(fù)驚厥閾下癇樣放電是否可引發(fā)實(shí)驗(yàn)大鼠較長時(shí)間的情緒喚醒障礙。方法 選擇6～7周齡雄性SD大鼠62只，成組設(shè)計(jì)，隨機(jī)分為驚厥閾下癇樣放電組 （subclinical epileptifor mdis charges group，SED組，n＝16）、海馬快速電點(diǎn)燃組（hippocampal kindling group，HK組，n＝16）、海馬電極埋植對照組（control of electrode group，EC組，n＝15）、正常對照組（normal control group，NC組，n＝15），建立大鼠反復(fù)SED動物模型，通過運(yùn)動活性、探究行為、拒俘反應(yīng)性、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)，觀測電刺激停止后1、7和30 d時(shí)實(shí)驗(yàn)大鼠情緒喚醒水平改變。結(jié)果 與EC組相比，電刺激后7 d，HK組、SED組大鼠曠場爬越行為明顯減少 （P＜0.01），后肢性站立、進(jìn)入高架十字迷宮開臂次數(shù)百分比和滯留時(shí)間百分比降低（P＜0.05），電刺激后30 d上述差異仍存在（P＜0.05），同時(shí)，HK組、SED組大鼠拒俘反應(yīng)性在電刺激后30 d有明顯增加（P＜0.01）。結(jié)論 反復(fù)驚厥閾下癇樣放電引起了實(shí)驗(yàn)大鼠持續(xù)性運(yùn)動活性減少、探究行為受抑、警覺水平過高、焦慮不安狀態(tài)、環(huán)境適應(yīng)能力下降、驚恐逃避反應(yīng)等多種情緒喚醒障礙。

反復(fù)驚厥閾下癇樣放電 癲癇 持續(xù)性情緒喚醒障礙

癲癇所致認(rèn)知功能受損與情感行為障礙成為嚴(yán)重影響患者臨床診治和預(yù)后的重要因素之一。近年來，隨著對沒有明顯癇性發(fā)作的腦電圖癇樣放電現(xiàn)象，即臨床下癇樣放電（subclinical epileptiform discharges，SEDs）或發(fā)作間癇樣放電（interictal epileptiform discharges），對認(rèn)知功能影響的臨床研究，加深了我們對癲癇性精神障礙的認(rèn)識［1－2］。我們在前期工作中對短期內(nèi)驚厥閾下癇樣放電引起的情感行為障礙進(jìn)行了初步研究［3－4］，但由于缺乏理想的動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停L時(shí)間反復(fù)驚厥閾下癇樣放電是否可引發(fā)更為持久的認(rèn)知及情感行為障礙目前仍不明確。為此，本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，建立起既可較長時(shí)間誘發(fā)癇樣腦電發(fā)放、又無明顯驚厥行為的大鼠驚厥閾下癇樣放電（subconvulsive epileptiform discharges，SED）動物模型，并重點(diǎn)觀察了反復(fù)驚厥閾下癇樣放電（rSED）對實(shí)驗(yàn)動物情感行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 6～7周齡健康雄性SD大鼠62只（第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），實(shí)驗(yàn)起始體質(zhì)量180～230 g，12 h光亮／黑暗條件、22～25℃環(huán)境溫度，分隔喂養(yǎng)。將大鼠隨機(jī)分為4組，驚厥閾下癇樣放電組（SED組，n＝16）、海馬快速電點(diǎn)燃組（hippocampal kindling group，HK組，n＝16）、海馬電極埋植對照組 （electrode control group，EC組，n＝15）及正常對照組（normal control group，NC組，n＝15）。SED、HK、EC組大鼠分別適應(yīng)1周后開始做手術(shù)植入電極。造模過程中出現(xiàn)死亡或不符合模型要求者，予以剔除并隨機(jī)補(bǔ)充，保證每組動物數(shù)量。

1.2 模型制備

1.2.1 電極包埋與固定 參考文獻(xiàn)［4］的辦法制備海馬電刺激模型：大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉溶液（30 mg／kg）腹腔注射麻醉后，固定在立體定位儀（NARISHIGE，Japan）上，沿中線切開頭皮并將肌肉等組織向兩側(cè)剝離后暴露出顱骨，清理干凈顱骨表面，待干燥后確定電極植入點(diǎn)。按大鼠腦圖譜［5］確定海馬CA1區(qū)電極埋植部位：記錄電極（單股鎳鉻合金電極，直徑0.2 mm）：前囟前2.5 mm、旁開2.0 mm，及前囟后5.0 mm、旁開3.5 mm處鉆穿顱骨，插入5.0 mm電極作為記錄用引導(dǎo)電極。刺激電極（雙股直徑0.2 mm鎳鉻合金漆包線旋扭一起而成，尖距0.1 mm，實(shí)驗(yàn)前用萬用電表和生理鹽水檢查電極的絕緣性）：前囟后4.2 mm，中線旁2.0 mm，深2.0 mm。用小型牙鉆（307-2型，上海醫(yī)療器械廠）鉆透顱骨，埋藏電極。各電極用牙托粉固定。術(shù)后觀察1 h，動物活動正常后即放回原飼養(yǎng)籠內(nèi)，允許術(shù)后恢復(fù)1周。實(shí)驗(yàn)過程中，HK、SED組分別各有1只動物因電極脫落而被剔除試驗(yàn)。

1.2.2 電刺激參數(shù) 采用SEN-3201電子刺激器（NIHON KOHDEN，Japan）進(jìn)行電刺激。海馬快速電點(diǎn)燃按Bengzon等［6］的方法稍加改進(jìn)：波寬1 ms、頻率16 Hz、串長10 s、刺激強(qiáng)度0.5 mA、串隔5 min，恒流、單向方波，平均刺激40次。海馬閾下刺激組采用我們前期實(shí)驗(yàn)［7］的刺激參數(shù)：頻率30 Hz、波寬1 ms、串長10 s、刺激強(qiáng)度0.1 mA，每天刺激10次，串隔5 min，連續(xù)刺激4 d，恒流、單向方波。

1.2.3 皮層腦電圖（electrocorticogram，ECoG）記錄采用6200四導(dǎo)生理記錄儀（成都儀器廠）記錄。實(shí)驗(yàn)前記錄1 min，實(shí)驗(yàn)后先連續(xù)記錄15 min，然后每隔5 min記錄1 min，共記錄60 min。以后每次實(shí)驗(yàn)前均記錄5 min，ECoG確認(rèn)存在癇樣放電后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，直至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。

1.2.4 癲癇發(fā)作分級參照Racine的標(biāo)準(zhǔn)［8］0級：腦電圖記錄有發(fā)作波形，而沒有抽搐動作；Ⅰ級：面肌抽動，咀嚼；Ⅱ級：節(jié)律性點(diǎn)頭；Ⅲ級：一側(cè)前肢陣攣；Ⅳ級：站立并雙前肢陣攣；Ⅴ級：持續(xù)站立和跌倒。

1.3 情感行為與空間學(xué)習(xí)記憶能力觀察

1.3.1 情感行為觀察 于電刺激后1、7和30 d時(shí)分別取每組大鼠各5只，觀察其情感行為改變：①大鼠運(yùn)動活性：將大鼠輕輕放入曠場行為觀察箱（按文獻(xiàn)［9－10］自制，60 cm×60 cm×60 cm的無頂木盒，箱底用墨線分為36個(gè)等份小方格）中央小方格內(nèi)，觀測5 min內(nèi)動物的活動情況。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：大鼠1／2以上身體從所在方格進(jìn)入相鄰方格，即爬越1次計(jì)1分，所得總分用于評價(jià)其運(yùn)動活性改變［9］；②探究行為：方法同上，觀察5 min內(nèi)大鼠后肢性站立計(jì)分改變。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：后肢性站立1次計(jì)1分，總分用于評價(jià)其探究行為改變［9］；③拒俘反應(yīng)性：以動物從未接觸過的手套輕抓大鼠，觀察其反應(yīng)。記分標(biāo)準(zhǔn)：0：很容易抓取動物；1：尖叫或回避；2：尖叫并回避；3：逃脫；4：逃脫并尖叫；5：咬或試圖撕咬手套；6：主動躍起攻擊，以此評價(jià)動物恐懼與沖突素質(zhì)特征改變［10］；④高架十字迷宮（按文獻(xiàn)［11］制備，木質(zhì)結(jié)構(gòu)，包括 2個(gè) 50 cm×10 cm的相對開臂和2個(gè)50 cm×10 cm×40 cm的相對閉臂，閉臂的上部敞開，迷宮中央有10 cm×10 cm的開闊部，迷宮離地面50 cm）實(shí)驗(yàn)：將大鼠置于迷宮中央，頭朝閉臂。分別記錄5 min內(nèi)大鼠進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)和在兩臂滯留時(shí)間 （以四肢全部入臂或出臂為準(zhǔn)），計(jì)算大鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)和在開臂滯留時(shí)間分別占總次數(shù) （進(jìn)入開臂與閉臂次數(shù)之和）及總時(shí)間（在開臂與閉臂滯留時(shí)間之和）的百分比，以此為評價(jià)焦慮指標(biāo)［11］。

1.3.2 主要觀察指標(biāo) 大鼠爬越行為、后肢性站立、拒俘反應(yīng)性、高架十字迷宮開臂次數(shù)與開臂時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Matlab6.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料均以（±s）表示。各組比較采用單因素方差分析進(jìn)行，同一時(shí)間各組間方差齊性采用Bartlett檢驗(yàn)，同一時(shí)間點(diǎn)不同組間兩兩比較用SNK法（用于方差齊性的大鼠爬越行為、拒俘反應(yīng)及開臂次數(shù)百分比的比較）和Tamhane’s T2法（用于方差不齊性的大鼠后肢性站立、開臂時(shí)間百分比的比較）進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 皮層腦電圖變化 正常大鼠海馬腦電以5～10 Hz的α波為主要表現(xiàn)，無明顯陣發(fā)性節(jié)律出現(xiàn)，波幅＜100 mV（圖1）。海馬電極埋植后動物腦電活動無明顯變化（圖2）。HK組大鼠在癇性發(fā)作時(shí)出現(xiàn)明顯的陣發(fā)性長時(shí)程高波幅多棘波或多棘慢波（圖3）。SED組大鼠在刺激后即可記錄到較多的單發(fā)或連續(xù)的高波幅尖波、棘波、棘慢波。隨著時(shí)間推移，癇樣放電逐漸減少，1月后仍可記錄到反復(fù)出現(xiàn)的發(fā)作性棘、尖、慢波活動（圖4）。

2.2 驚厥行為觀察 NC組和EC組大鼠無驚厥樣表現(xiàn)。HK組大鼠在電刺激5～16次后出現(xiàn)活動逐漸減少，伴有“濕犬樣”抖動及撓頭動作，再經(jīng)歷4～9次電刺激后開始出現(xiàn)下頜快速咬動或顏面肌抽搐，隨后很快出現(xiàn)發(fā)作性四肢及全身強(qiáng)直，四肢直立，最后跌倒。刺激停止1 h后發(fā)作基本停止。整個(gè)發(fā)作以強(qiáng)直、陣攣表現(xiàn)為主。根據(jù)Racine的標(biāo)準(zhǔn)［8］，HK組大鼠的發(fā)作表現(xiàn)均已達(dá)到Ⅲ～Ⅴ級。SED組大鼠在電刺激過程中可觀察到先出現(xiàn)活動減少，之后逐漸表現(xiàn)出一定的興奮性，修飾行為或“洗臉”行為增多，但未觀察到Ⅰ級以上（含Ⅰ級）驚厥發(fā)作。

2.3 大鼠電刺激后不同時(shí)間情感行為觀察結(jié)果

圖1 NC組大鼠ECoG記錄

圖2 EC組大鼠ECoG記錄

圖3 HK組大鼠ECoG記錄（電刺激后驚厥發(fā)作時(shí)）

圖4 SED組大鼠ECoG記錄（電刺激后30 d）

表1 四組大鼠的爬越行為計(jì)分改變

表2 四組大鼠礦場實(shí)驗(yàn)中的站立次數(shù)

表3 四組大鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)／總次數(shù)

2.3.1 大鼠電刺激后不同時(shí)間曠場行為改變和高架十字迷宮行為改變結(jié)果 表1顯示，SED組、HK組大鼠電刺激后1 d內(nèi)曠場爬越行為明顯減少，顯示其運(yùn)動活性降低，至30 d時(shí)上述差異仍非常明顯；表2顯示，電刺激后1 d及7 d時(shí)HK組、SED組大鼠后肢性站立顯著減少，表明其探究行為明顯降低，至30 d時(shí)雖有所恢復(fù)，但仍存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；表3、表4顯示，電刺激后1 d及7 d，HK組、SED組大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時(shí)間百分比均降低，電刺激后30 d，上述兩組實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比仍降低，進(jìn)入開臂滯留時(shí)間百分比僅較EC組存在差異，但P值已經(jīng)接近0.05。

2.3.2 大鼠捕食應(yīng)激后不同時(shí)間拒俘反應(yīng)性結(jié)果表5顯示，HK組、SED組大鼠拒俘反應(yīng)性在電刺激后1、7及30 d時(shí)均明顯增強(qiáng)。

表4 四組大鼠進(jìn)入開臂滯留時(shí)間／總時(shí)間

表5 四組大鼠的拒俘反應(yīng)性

3 討論

在前期研究中證實(shí)發(fā)作間癇樣放電確實(shí)可引發(fā)實(shí)驗(yàn)動物短暫學(xué)習(xí)和記憶能力受損，同時(shí)亦觀察到SED還可引發(fā)實(shí)驗(yàn)動物程度更明顯、持續(xù)時(shí)間更長的活動習(xí)性改變、警覺水平增高、焦慮不安狀態(tài)、環(huán)境適應(yīng)能力下降等情緒喚醒障礙［3－4］。鑒于前期研究中的動物模型癇樣放電持續(xù)時(shí)間較短，放電頻率少，因此我們通過調(diào)整電刺激波寬、頻率、串長、刺激強(qiáng)度、串隔與刺激總次數(shù)，使SED組大鼠在電刺激停止后1月內(nèi)均能記錄到反復(fù)發(fā)放的高幅棘、尖、慢波等癇樣腦電活動，且無明顯的驚厥行為，為進(jìn)一步探討反復(fù)驚厥閾下電刺激（rSED）對情緒喚醒水平的影響提供了理想的實(shí)驗(yàn)動物模型。

曠場實(shí)驗(yàn)是經(jīng)典的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，能很好的評定動物的情緒性水平以及在開放的陌生環(huán)境中的探究行為，可用來測試動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的“興奮”或“抑制”狀態(tài)，是檢測實(shí)驗(yàn)動物情緒喚醒水平的一種重要方法［9－10］。中央格停留時(shí)間是動物對環(huán)境適應(yīng)能力的反映，如果對新環(huán)境的適應(yīng)能力差，則大鼠停留在中央格的時(shí)間延長。爬越次數(shù)則代表大鼠的興奮性狀態(tài)。動物初入陌生環(huán)境可出現(xiàn)明顯的防護(hù)性情感反應(yīng)，表現(xiàn)為迅速離開中央格，沿周邊活動，這對于量化分析實(shí)驗(yàn)動物的警覺水平、焦灼狀態(tài)、環(huán)境適應(yīng)能力等有重要意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SED組大鼠電刺激后1、7和30 d內(nèi)曠場爬越行為明顯減少，提示其新環(huán)境中運(yùn)動活性顯著降低；拒俘反應(yīng)性同步顯著增強(qiáng)，顯示其受驚嚇程度嚴(yán)重、沖突特性增強(qiáng)、易激惹、掙扎行為明顯；電刺激后1 d及7 d時(shí)后肢性站立減少，30 d仍減少，表明其挫折感明顯、探究行為顯著受抑。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，反復(fù)SED可致實(shí)驗(yàn)大鼠在新環(huán)境中的警覺水平明顯增高、易激惹、適應(yīng)能力顯著下降，在刺激后較長時(shí)間內(nèi)一直處于驚恐逃避情感反應(yīng)中。

高架十字迷宮試驗(yàn)則是以動物自發(fā)行為為基礎(chǔ)，利用動物對新異環(huán)境的探究特性，以及對高懸敞開臂的恐懼感而形成的矛盾沖突狀態(tài)來評價(jià)實(shí)驗(yàn)動物焦慮素質(zhì)特征的［11］，其通過進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時(shí)間百分比反映動物的焦慮狀態(tài)，焦慮動物上述指標(biāo)均明顯降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，電刺激后1 d及7 d，實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和開臂滯留時(shí)間百分比均降低，電刺激后30 d，實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比仍降低，提示反復(fù)SED對大鼠有明顯的長時(shí)間的致焦慮效應(yīng)。雖然，電刺激后30 dHK組、SED組大鼠進(jìn)入開臂時(shí)間百分比較EC組仍存在差異，可以說明反復(fù)驚厥閾下癇樣放電對實(shí)驗(yàn)動物焦慮情緒仍存在持續(xù)性影響，但差異已經(jīng)非常微?。≒值已接近0.05），同時(shí)HK組、SED組大鼠較NC組已經(jīng)無差異，是否說明電極本身對實(shí)驗(yàn)大鼠的影響和癇樣放電對實(shí)驗(yàn)大鼠的影響產(chǎn)生了“拮抗”作用，尚需進(jìn)一步觀察和討論。

通過海馬反復(fù)驚厥閾下電刺激，成功誘發(fā)了實(shí)驗(yàn)動物明顯而持續(xù)的運(yùn)動活性減少、探究行為受抑、警覺水平過高、焦慮不安狀態(tài)、環(huán)境適應(yīng)能力下降、驚恐逃避反應(yīng)等多種情緒喚醒障礙。因此，反復(fù)SED可能引發(fā)包括抑郁、焦慮等更為持久的情感行為異常與社會適應(yīng)能力下降。反過來我們有理由推測，對于抑郁癥、焦慮癥等臨床患者，無明顯癇性發(fā)作表現(xiàn)的SED現(xiàn)象亦可能是部分患者的重要發(fā)病原因之一。但對反復(fù)SED的直接作用能引起何種神經(jīng)生物學(xué)改變尚并不明確，亟待進(jìn)一步探討。

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（責(zé)任編輯：李立）

Recurrent subconvulsive epileptiform discharges facilitate persistent emotionality disorder in rats.

XIANGYang，WANG Qingsong，ZHENG Yu.Department of Neurology，Chengdu General Hospital of Chengdu Military Area Command of Chinese PLA，Chengdu 610083，China.Tel：028－86570712.

Objective To investigate whether or not recurrent subconvulsive epileptiform discharges may facilitate the persistent emotionality disorder in rats.Methods Sixty-two male SD rats aged from 6 to 7 weeks old were selected and divided randomly into 4 groups： SED group（n＝16）for rats with recurrent subconvulsive epileptiform discharges，HK group（n＝16）for hippocampal kindling，EC group（n＝15）for control of electrode，NC group（n＝15）for normal control.The changes in emotionality of experimental rats were tested by locomotor activity，exploratory behavior，capture-resistance and elevated plus-maze（EPM）test at 1，7，30 d after electrical stimulations.Results Compared with the EC group， at 7 d after electrical stimulation，rats in the HK，SED group displayed a significantly decrease in number of creeping（P＜0.01），and the standing on hind limbs，the percentages of open-arm entries and open-arm retention time in EPM test was decresed（P＜0.05），and the difference still existed at 30 day after electrical stimulation（P＜0.05）.And the capture-resistance in rats in the HK，SED group was significantly increased at 30 day after electrical stimulation（P＜0.01）. Conclusions Recurrent subconvulsive epileptiform discharges causes the persistent emotionality as decreased locomotor activities，suppressed exploratory behavior，enhanced startle，delayed habituation，increased anxiety and defense reaction.

Recurrent subconvulsive epileptiform discharges（rSED） Epilepsy Persistent emotionality disorder

R742.1

A

2011－03－14）

☆ 四川省衛(wèi)生廳科研課題（編號：070389）

* 成都軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（成都 610083）

△ 成都軍區(qū)總醫(yī)院腎臟內(nèi)科

（E-mail：wqs832001＠sina.com）