eNOS基因多態(tài)性與漢族人糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系

盧瑞春王昊郁金泰譚蘭

·論 著·

eNOS基因多態(tài)性與漢族人糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系

盧瑞春*王昊△郁金泰*譚蘭*

目的 探討內(nèi)皮型一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，eNOS）基因第4內(nèi)因子基因27 bp數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列（variable number of tandem repeats，VNTR）多態(tài)性與糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系。方法 納入189例糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬者和240名對(duì)照，分析各組間的等位基因頻率與基因型頻率的差異。結(jié)果 糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化患者的 a等位基因頻率高于對(duì)照組 （9.78%、6.04%，χ2＝4.119，P＜0.05），差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；4a／4b＋4a／4a基因型頻率在糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化組高于對(duì)照組 （17.38%、11.65%，χ2＝5.518，P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)4a等位基因與糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化具有顯著相關(guān)性（OR＝1.594，95%CI 1.256－1.741，P＜0.000）。用多元Logistic回歸分析校正了年齡、高血壓、高血脂、體重指數(shù)和吸煙等危險(xiǎn)因素的影響后，a等位基因是糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的遺傳危險(xiǎn)因素（OR＝0.717，P＜0.001）。證實(shí)eNOS基因VNTR多態(tài)性是影響漢族人群中糖尿病患者發(fā)生頸動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論 在漢族人群中糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病與內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）第4內(nèi)含子a等位基因密切相關(guān)。

內(nèi)皮型一氧化氮合酶 基因多態(tài)性 糖尿病 頸動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化和心腦血管疾病密切相關(guān)， 其中頸動(dòng)脈粥樣硬化（carotid atherosclerosis）被認(rèn)為是缺血性卒中的重要危險(xiǎn)因素之一［1］。 頸動(dòng)脈粥樣硬化是全身性動(dòng)脈粥樣硬化的局部表現(xiàn)，是腦血管病的重要原因之一［2］，也是糖尿病并發(fā)大血管病變的主要并發(fā)癥之一。 糖尿病并發(fā)頸動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率很高，其發(fā)生發(fā)展受許多因素影響，如吸煙、肥胖、脂代謝異常和高血壓等。有研究表明這些已知危險(xiǎn)因素僅增加糖尿病患者的心腦血管疾病發(fā)病率的25%～30%［3］，這說明在糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中還有其他因素起著重要作用。已有研究證實(shí)，一氧化氮（nitric oxide，No）是抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成的關(guān)鍵因素［4］。而一氧化氮合酶 （endothelial nitric oxide synthase，eNOS）第4內(nèi)含子基因數(shù)目可變性串聯(lián)重復(fù)序列（variable number of tandem repeats，VNTR）多態(tài)性與NO的功能密切相關(guān)［5］。eNOS第4內(nèi)含子基因數(shù)目VNTR多態(tài)性是否影響漢族人糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 糖尿?。?型）并頸動(dòng)脈粥樣硬化組（病例組）：189例，男102例，女87例；年齡45～95歲，平均（60.4±8.1）歲。均來自2005～2009年青島市市立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院患者。對(duì)照組：240例，男125例，女115例，平均年齡（58.3±5.6）歲，此組經(jīng)體檢、實(shí)驗(yàn)室及心電圖檢查，僅有糖尿病，排除頸動(dòng)脈粥樣硬化、腦血管疾病、心肌梗死、肝腎功能不良等情況。入組標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者的糖尿?。?型）診斷均符合美國(guó)糖尿病聯(lián)合協(xié)會(huì)的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］；②采用彩色多普勒超聲儀確診為頸動(dòng)脈粥樣硬化并確定狹窄程度。排除標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)顱腦TCD、頭顱CT及MRI檢查證實(shí)，排除腦卒中疾??；②心肌梗死病史；③急慢性感染、腫瘤或自身免疫性疾病患者及有明顯的肝功能、腎功能障礙或心功能衰竭者。被檢查者均以發(fā)現(xiàn)頸總動(dòng)脈或（和）頸內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊為陽性，每例被檢查者不計(jì)斑塊數(shù)，只計(jì)例數(shù)。對(duì)所有研究對(duì)象記錄臨床特征如：民族、年齡、性別、血壓、血脂、有無吸煙嗜好及體重指數(shù)等。

1.2 方法 試驗(yàn)前DNA的提?。呵耙菇?2 h以上，次晨空腹抽取檢查對(duì)象外周靜脈血2 mL，經(jīng)EDTA抗凝，用于提取基因組DNA。

1.2.1 基因型檢測(cè)

1.2.1.1 基因組DNA提取 EDTA抗凝全血2，分離出淋巴細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解和蛋白酶K消化后，常規(guī)酚－氯仿抽提DNA。

1.2.1.2 多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增目的片斷 上游引物：5′-GCCCTATGGTAGTGCCTTGGCTGGA-3′； 下 游 引 物 ：5′-GAGGCTGCTCCTGCTACTGACAGCAC-3′。經(jīng)過PCR擴(kuò)增目的片斷，實(shí)驗(yàn)方法與H.G.Wang相同［7］。取3 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上做垂直電泳，電壓60 V，時(shí)間3 h，PCR Marker作參照，在0.5 μg／mL溴化乙錠染液中染色40 min后在紫外線燈下觀察結(jié)果。

1.2.1.3 基因型的確定 PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠分離，溴化乙錠染色，紫外燈下確定基因型。

1.2.1.4 基因序列測(cè)定 不同基因型的擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工公司測(cè)定DNA序列，明確VNTR長(zhǎng)度和重復(fù)次數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。為考察資料的可靠性對(duì)糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化組和對(duì)照組的基因型分布進(jìn)行 Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)；基因型頻率和等位基因頻率差異采用χ2檢驗(yàn)；采用logistic回歸計(jì)算OR值及其95%CI。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 eNOS基因27 bp VNTR基因多態(tài)分型及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮合酶基因型多態(tài)性表現(xiàn)為數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列（variable number of tandem repeat，VNTR），5次重復(fù)等位基因的PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)420 bp和4次重復(fù)等位基因的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)393 bp。（見圖1）共有3種基因型：aa，ab，bb。電泳后條帶分為3種：只有393 bp條帶為aa基因型，只有420 bp條帶為bb基因型，同時(shí)有393 bp和420 bp條帶的為雜合ab基因型。

2.2 臨床特征 對(duì)糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化組（病例組）和對(duì)照組樣本的臨床特征進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化組的血壓、血脂、體重指數(shù)、年齡及吸煙比例明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；而兩組間的性別構(gòu)成相匹配（P＞0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 遺傳平衡檢驗(yàn) 將病例組和對(duì)照組的eNOS各基因型頻率代入 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，進(jìn)行群體代表性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示eNOS各基因型頻率與期望值基本吻合，Waldχ2值分別為3.50和0.02，P＞0.05，基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。

2.4 eNOS基因a／b多態(tài)性與糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)聯(lián)分析 糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化組（病例組）組與對(duì)照組的ab基因型頻率分別為15.21%和11.25%，兩者比較有顯著差異 （P＜0.05）。a等位基因頻率在病例組為9.78%，較對(duì)照組（6.04%）明顯偏高（P＜0.05）（見表1）。Logistic回歸分析顯示，4a等位基因與糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化具有顯著相關(guān)性 （OR＝1.594，95%CI 1.256～1.741，P＝0.000），a等位基因是糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖譜

表1 eNOS基因型及等位基因頻率分布的比較

表2 糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的多因素logistic回歸分析

2.5 多因素條件logistic回歸分析 多因素logistic回歸分析去除血壓、血脂、體重指數(shù)、年齡及吸煙后，4a等位基因與頸動(dòng)脈粥樣硬化仍相關(guān) （OR＝0.717，95%CI＝0.547-0.987，P＝0.001）（見表2）。

3 討論

NO是體內(nèi)重要的抗動(dòng)脈粥樣硬化的分子［8］。NO半衰期很短，其生物合成完全依賴eNOS的催化，eNOS的表達(dá)直接關(guān)聯(lián)產(chǎn)生NO的量［9］。eNOS基因多態(tài)性可能影響eNOS蛋白的功能及活性，降低NO的合成，加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，從而引發(fā)血栓形成及心腦血管疾?。?0］。TSUKADA等［11］研究發(fā)現(xiàn)27 bp VNTR多態(tài)性與基礎(chǔ)的內(nèi)皮NO釋放水平有關(guān)，帶4a等位基因基礎(chǔ)的內(nèi)皮NO釋放水平明顯低于不帶4a等位基因者。但是，WANG等［12］研究卻得出不同結(jié)論：eNOS基因第4內(nèi)含子的VNTR多態(tài)性與eNOS酶功能活性有關(guān)，4a等位基因攜帶者eNOS酶活性比4b等位基因攜帶者高7倍，血漿NO水平明顯升高。eNOS基因多態(tài)性的效應(yīng)可能最終要通過影響NO的生成來實(shí)現(xiàn)，但其具體機(jī)制還需要深入的研究。

Salimi等［13］研究發(fā)現(xiàn)eNOS基因第4內(nèi)含子基因的多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化有著密切聯(lián)系，而eNOS基因第4內(nèi)含子基因的多態(tài)性與血漿中NO的水平無關(guān)。Fatini等［14］研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)eNOS基因第4內(nèi)含子的a等位基因?yàn)轭i動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素。Fatma S等［15］研究亦認(rèn)為：eNOS基因第4內(nèi)含子的a等位基因可能為動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Ji Hyun Park等［16］研究表明：在韓國(guó)人群中eNOS基因第4內(nèi)含子的VNTR多態(tài)性與2型糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化有明顯相關(guān)性；eNOS基因第4內(nèi)含子的a等位基因可能為糖尿病患者頸動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此結(jié)論與本研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在漢族人群中糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化患者的a等位基因頻率高于對(duì)照組 （9.78%、6.04%），且差別有顯著區(qū)別；4a／4b＋4a／4a基因型頻率在糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化組和對(duì)照組分別為 17.38%和 11.65%（χ2＝5.518，P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。用多元Logistic回歸分析校正了年齡、高血壓、高血脂、體重指數(shù)和吸煙等危險(xiǎn)因素的影響后，a等位基因是糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的遺傳危險(xiǎn)因素（P＝0.001，OR＝0.717）。證實(shí)eNOS基因VNTR多態(tài)性是影響漢族人群中糖尿病患者發(fā)生頸動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。同時(shí)我們還分析了一些臨床特征與糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)年齡、高血脂、吸煙和肥胖是在漢族人群中糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要風(fēng)險(xiǎn)因子。

本研究首次報(bào)道了漢族人群中eNOS基因27 bp VNTR多態(tài)性為糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的危險(xiǎn)因素，但由于研究所選的樣本具有地域限制，不能代表整體人群。所以，eNOS基因27 bp VNTR多態(tài)性是否與糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化有密切關(guān)系還需多中心進(jìn)一步研究。

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Association study between the polymorphisms of nitric oxide synthase gene and carotid atherosclerosis in type 2 diabetic in the Chinese Han population.

LU Ruichun， WANG Hao， YU Jintai， TAN Lan.Department of neurology，Qing Dao Municipal Hospital，Qingdao 266071，China.Tel：053－288905686.

Objective To investigate the association between 27-base pair repeats polymorphism in intron 4 of eNOS gene and carotid atherosclerosis in type 2 diabetic in the Chinese Han population. Methods The two polymorphisms were analyzed in 189 patients of carotid atherosclerosis in type 2 diabetic and 240 controls of Chinese origin using polymerase chain reaction and its products were directly sequenced. Results The eNOS4a allele distribution frequency of eNOS gene in carotid atherosclerosis in type 2 diabetic group（9.78%）was higher than that in control group （6.04%）， and4a／4b＋4a／4a distribution frequency of eNOS gene in carotid atherosclerosis in type 2 diabetic group （17.38%） was also higher than that in control group （11.65%）.Both differences between carotid atherosclerosis in type 2 diabetic group and control group were significant（all P＜0.05）.Marker eNOS4a allele was found associated with carotid atherosclerosis in type 2 diabetic（OR＝1.594，95%CI＝1.256－1.741，P＝0.000）.After adjusted，a association was observed for eNOS4a allele using multivariate logistic regression analysis（P＝0.001，OR＝0.717）.Conclusions eNOS gene promoter polymorphisms are associated with ischemic stroke.the eNOS4a allele may rise the risk of carotid atherosclerosis in type 2 diabetic patients in the Chinese Han population.

Nitric oxide synthase Polymorphism Diabetes mellitus Carotid atherosclerosis

R743.3

A

2011－03－11）

（責(zé)任編輯：李立）

* 青島市市立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（青島 266071）

△ 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院

（Email：dr.tanlan＠163.com）