負(fù)壓封閉引流技術(shù)對(duì)兔外周血炎癥因子的影響

楊 帆，胡 耑，白祥軍，李 波，李仁杰，張 錕，薛晨晨

負(fù)壓封閉引流(vacuum sealing drainage，VSD)技術(shù)是一種負(fù)壓創(chuàng)面治療的物理方式，經(jīng)過10余年的應(yīng)用和推廣，已經(jīng)在創(chuàng)面修復(fù)方面取得了巨大的成功［1－3］。同時(shí)我們?cè)谂R床上發(fā)現(xiàn)VSD還可以降低患者全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、膿毒癥(sepsis)的“二次打擊”［4－5］。白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell，WBC)和C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)能夠有效監(jiān)測(cè)炎癥反應(yīng)和感染發(fā)生;而腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)則是炎癥網(wǎng)絡(luò)中的核心代表。本實(shí)驗(yàn)通過前瞻性對(duì)照研究，觀察VSD技術(shù)對(duì)兔創(chuàng)傷模型外周血WBC、CRP、TNF-α和IL-6的影響，探討VSD技術(shù)對(duì)感染、炎癥的影響并探討其可能機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12只普通級(jí)健康日本大耳白兔，體質(zhì)量2.5～3.5 kg，雌雄不限，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(鄂)-2008-0005-0007101。

2 動(dòng)物建模和分組

8%硫化鈉于兔背部脫毛并適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后稱重，氯胺酮30mg/kg耳緣靜脈注射麻醉，兔背部脫毛區(qū)消毒，全層切開皮膚直至肌肉層，形成2cm×2cm的創(chuàng)面，壓迫止血。

12只建模后實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為:(1)常規(guī)組6只，創(chuàng)面每日行常規(guī)換藥;(2)負(fù)壓組6只，創(chuàng)面行VSD手術(shù)后持續(xù)以－193.75mmHg(25.8kPa)的負(fù)壓吸引，如VSD有漏氣和敷料堵塞，則及時(shí)更換。設(shè)定建模前12只實(shí)驗(yàn)兔為正常對(duì)照，檢測(cè)各兔外周靜脈血中WBC計(jì)數(shù)、CRP、TNF-α和IL-6的正常含量。

上述實(shí)驗(yàn)兔均在特制單籠條件中進(jìn)行飼養(yǎng)，有效避免創(chuàng)面污染和貼膜破損漏氣。一旦實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)標(biāo)本溶血、凝固則立即重新采集，若實(shí)驗(yàn)兔死亡，則重新入組新實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。

3 主要儀器、材料和試劑

3.1 儀器:便攜式負(fù)壓吸引儀(武漢維斯第公司)、Cell-PYN Sapphire全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(美國(guó)Abbott公司)、Aeroset全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)Abbott公司)、BNⅡ特種蛋白分析儀(德國(guó)Siemens公司)、Labofuge 400R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)、Denley dragon wellscan MK3酶標(biāo)儀和Ascent software for multiskan分析軟件(芬蘭Thermo公司)。

3.2 材料:VSD一次性使用負(fù)壓引流護(hù)創(chuàng)材料(武漢維斯第公司)、特制飼養(yǎng)籠(武漢同濟(jì)醫(yī)院)。

3.3 試劑:CRP檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Dade behring公司)、TNF-α檢測(cè)ELISA試劑盒(北京博奧森公司)、IL-6檢測(cè)ELISA試劑盒(北京博奧森公司)。

4 標(biāo)本的采集和測(cè)定

4.1 WBC血液標(biāo)本:負(fù)壓組和常規(guī)組于建模后7天內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)(6、12小時(shí)、1、3、5、7天)，于兔耳緣靜脈抽取外周靜脈血1ml，注入血常規(guī)試管，4℃保存，60分鐘內(nèi)送檢。應(yīng)用Cell-PYN Sapphire全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀自動(dòng)進(jìn)行兔外周靜脈血中WBC計(jì)數(shù)。

4.2 CRP血液標(biāo)本:負(fù)壓組和常規(guī)組于建模后7天內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)(6、12小時(shí)、1、3、5、7天)，于兔耳緣靜脈抽取外周靜脈血1ml，4℃、3 000rpm離心5分鐘取上清，4℃保存，60分鐘內(nèi)送檢。采用動(dòng)態(tài)定時(shí)散射比濁法，應(yīng)用BNⅡ特種蛋白分析儀及CRP試劑盒自動(dòng)檢測(cè)兔外周靜脈血中CRP含量。

4.3 TNF-α和IL-6血液標(biāo)本:負(fù)壓組和常規(guī)組于建模后7天內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)(6、12小時(shí)、1、3、5、7天)，于兔耳緣靜脈抽取外周靜脈血1ml，4℃、3 000rpm離心5分鐘取上清，－80℃冷凍保存待測(cè)，避免反復(fù)凍融。以ELISA法檢測(cè)，采用北京博奧森公司TNF-α和IL-6檢測(cè)試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

同時(shí)以建模前兔外周靜脈血為對(duì)照(0秒)，同上操作采集和測(cè)定相關(guān)標(biāo)本。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件，WBC計(jì)數(shù)、CRP、TNF-α和IL-6的含量均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05作為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié) 果

1 負(fù)壓組和常規(guī)組外周靜脈血WBC計(jì)數(shù)和CRP含量的變化(見表1)

由表1可知，建模前兩組外周血WBC計(jì)數(shù)和CRP含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，具有可比性。自6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)起負(fù)壓組的外周血WBC計(jì)數(shù)和CRP含量較常規(guī)組顯著性降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2 負(fù)壓組和常規(guī)組外周靜脈血TNF-α和IL-6含量的變化(見表2)

由表2可知，建模前外周靜脈血TNF-α和IL-6含量無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，具有可比性。建模后兩組TNF-α和IL-6含量均開始增高。自1天時(shí)間點(diǎn)起負(fù)壓組的外周靜脈血TNF-α含量較常規(guī)組顯著性降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。自6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)起負(fù)壓組的外周靜脈血IL-6含量較常規(guī)組顯著性降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 外周靜脈血WBC計(jì)數(shù)和CRP含量的變化(n=6)

表2 外周靜脈血TNF-α和IL-6含量的變化(n=6)

討 論

嚴(yán)重創(chuàng)傷患者由于病程中經(jīng)歷創(chuàng)傷和失控性炎癥的雙重打擊［6］，易導(dǎo)致炎癥遞質(zhì)的異常表達(dá)和發(fā)生序貫性的多器官功能障礙綜合征(MODS)，臨床上治療極其棘手，很大一部分患者死于繼發(fā)的多臟器衰竭(MOF)，成為復(fù)蘇后期的主要死因。我們?cè)谂R床上觀察到，VSD技術(shù)不僅有助于促進(jìn)肉芽組織和創(chuàng)面生長(zhǎng)，而且可以顯著降低SIRS、膿毒癥和MODS的發(fā)生率，這可能同局部負(fù)壓治療參與全身炎癥因子信號(hào)的調(diào)控相關(guān)［7］。我們通過觀察WBC和CRP作為VSD術(shù)后感染指標(biāo)，TNF-α和IL-6在外周血中含量的變化，研究VSD技術(shù)對(duì)感染和炎癥的干預(yù)效果并探討其可能機(jī)制。

1 白細(xì)胞計(jì)數(shù)和C反應(yīng)蛋白

當(dāng)機(jī)體遭受創(chuàng)傷或者細(xì)菌入侵后，以中性粒細(xì)胞為首的WBC群，通過細(xì)胞吞噬與增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，共同消滅細(xì)菌，預(yù)防感染，是一種非特異性免疫的直接效應(yīng)細(xì)胞。活化的WBC還可以通過釋放炎癥介質(zhì)、增加血管通透性、產(chǎn)生趨化作用等參加局部的炎癥反應(yīng)。

CRP是在IL-6等細(xì)胞因子調(diào)節(jié)下，主要由肝臟合成分泌的一種蛋白質(zhì)，也可由炎癥局部的巨噬細(xì)胞少量產(chǎn)生。CRP以糖蛋白的形式存在于血液中，能增強(qiáng)白細(xì)胞的吞噬能力、增強(qiáng)淋巴細(xì)胞活性、激活補(bǔ)體等作用。大量研究表明，但當(dāng)機(jī)體存在創(chuàng)傷、感染、急性炎癥等應(yīng)激情況時(shí)，CRP是急性時(shí)相蛋白(acute phase protein，APP)中變化最敏感的一種，也是目前評(píng)價(jià)炎癥和感染程度最為敏感的指標(biāo)［8］。

我們的研究表明，自建模后6小時(shí)起負(fù)壓組的外周血WBC計(jì)數(shù)和CRP含量較常規(guī)組顯著性降低(P＜0.05)。這可能同以下機(jī)制相關(guān)［9］:(1)貼膜可將創(chuàng)面與外界隔絕，以防止清創(chuàng)后的創(chuàng)面進(jìn)一步被污染，減少創(chuàng)面細(xì)菌附著數(shù)量，預(yù)防感染發(fā)生;(2)持續(xù)負(fù)壓吸引可清除創(chuàng)面壞死物質(zhì)和滲出液，以及其中的細(xì)菌，直接減少創(chuàng)面細(xì)菌數(shù)量和細(xì)菌培養(yǎng)基，從而避免感染發(fā)生和WBC升高;(3)及時(shí)清除富含炎癥遞質(zhì)的滲出液和壞死物，亦可降低CRP的反應(yīng)性分泌。

2 TNF-α和IL-6

炎癥遞質(zhì)通過相互調(diào)節(jié)形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，TNF-α和IL-6是共同參與創(chuàng)傷后機(jī)體炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞因子。適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)可以將細(xì)胞因子水平維持在適當(dāng)?shù)乃剑欣诩?xì)胞免疫和機(jī)體恢復(fù);如果過度釋放和調(diào)節(jié)失控，則會(huì)誘發(fā)SIRS。所以有效調(diào)控這些炎癥細(xì)胞因子含量，是控制全身失控性炎癥反應(yīng)和預(yù)防MODS的關(guān)鍵［10］。

我們的研究表明，建模前外周靜脈血TNF-α含量非常低，一旦發(fā)生創(chuàng)傷應(yīng)激，TNF-α的含量迅速升高，12小時(shí)即達(dá)到基礎(chǔ)值的6～7倍，隨后迅速下降，1天后各時(shí)相點(diǎn)上，兩組比較其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。這可能與TNF-α作為啟動(dòng)因子，在創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)早期(12小時(shí)內(nèi))受創(chuàng)面大小和血管內(nèi)皮損傷程度的直接調(diào)控;在無(wú)干預(yù)措施的對(duì)照組，炎癥反應(yīng)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，各種炎癥遞質(zhì)互相作用，即開始產(chǎn)生“瀑布樣”效應(yīng)，刺激TNF-α等炎癥因子迅速、大量釋放;相反，負(fù)壓組由于VSD持續(xù)清除創(chuàng)面富含炎癥因子的壞死物質(zhì)和滲出液，切斷了TNF-α進(jìn)一步放大的通路，迅速下調(diào)TNF-α及其含量，控制了炎癥反應(yīng)持續(xù)發(fā)展。而外周靜脈血IL-6含量變化，在建模前兩組含量相近，但自6小時(shí)時(shí)相點(diǎn)起負(fù)壓組的外周靜脈血IL-6含量較常規(guī)組顯著降低(P＜0.05)?？赡軝C(jī)制有:IL-6受到機(jī)體應(yīng)激和炎癥因子雙重調(diào)控，雖然在早期(12小時(shí)內(nèi))兩組的TNF-α含量無(wú)顯著性差異，但是應(yīng)激狀態(tài)已經(jīng)開始發(fā)生變化，負(fù)壓組刺激源強(qiáng)度下調(diào)，導(dǎo)致建模后IL-6含量也持續(xù)較常規(guī)組減低。

綜上所述，WBC、CRP、TNF-α和IL-6不僅是感染和炎癥反應(yīng)程度的重要評(píng)估指標(biāo)，而且由于之間互相作用和調(diào)控，共同參與了感染和炎癥反應(yīng)的全過程，可能在SIRS、膿毒癥和MODS的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。而VSD技術(shù)能夠在創(chuàng)傷早期通過清除病因，以削弱應(yīng)激源的放大作用，避免了失控性炎癥反應(yīng)和MODS的發(fā)生，有利于創(chuàng)面的愈合。

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