飼料嘔吐毒素生物降解研究進(jìn)展

王金全 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081

嘔吐毒素(Vom itoxin)，又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxyniva1eno1,DON)，是一種無色針狀結(jié)晶,熔點(diǎn)為151-152℃,具有較強(qiáng)的熱抗力,121℃高壓加熱25 m in僅少量破壞。嘔吐毒素是由鐮刀菌屬（Fusarium）產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物，屬于單端孢霉烯族化合物(Desjardins,2006)圖1。鐮刀菌屬通常在作物生長期間就被污染，其最適生長溫度為5～25°C，最適生存環(huán)境為長江以北大部分地區(qū)。嘔吐毒素多分布于小麥、大麥、玉米等谷物籽實(shí)中。在谷物和飼料中檢出率極高，是在黃曲霉毒素之后污染最嚴(yán)重的霉菌毒素。

圖1 基本結(jié)構(gòu)Basic structure of trichothecenes(R1,R2,R3,R4和 R5可以為-H,-OH,-OAC,-COCH2CH(CH2)2,或 =O 的功能集團(tuán))，(Cole and Cox,1981)

嘔吐毒素對人和動物均有很強(qiáng)的毒性，12，13-環(huán)氧基團(tuán)是嘔吐毒素的毒性結(jié)構(gòu)（圖1），能引起人和動物嘔吐、腹瀉、皮膚刺激、拒食、神經(jīng)紊亂、流產(chǎn)、死胎等(Desjardins,2006;Eriksen et a1.,2004;Morgavi and Ri1ey,2007)，豬是對嘔吐毒素最敏感的動物，家禽次之，反芻動物由于瘤胃微生物的作用，耐受力最強(qiáng)。對生長肥育豬而言,含有14 ppm 嘔吐毒素的飼料飼喂后10～20m in即會出現(xiàn)嘔吐、不正常的焦慮和磨牙現(xiàn)象。在含毒量10 ppm以上即完全拒食 (Trenho1m等,1994;W i11iams等,1988)。

嘔吐毒素具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,它對于原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、植物細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等均具有明顯的毒性作用。它對于生長較快的細(xì)胞如胃腸道黏膜細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞、骨髓造血細(xì)胞等均有損傷作用，嘔吐毒素可能通過3種不同的方式對原核細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用∶（1）通過滲透磷脂雙層,作用于亞細(xì)胞水平;（2）通過與細(xì)胞膜相互作用;（3）通過自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用。

嘔吐毒素是一種免疫抑制劑,它能抑制蛋白質(zhì)和DNA、RNA的合成，抑制線粒體的功能，阻止細(xì)胞分裂和膜的功能，嘔吐毒素通過其倍半萜烯結(jié)構(gòu)抑制轉(zhuǎn)錄、翻譯過程，產(chǎn)生免疫抑制作用。(Azcona-O1ivera et a1.,1995;Ne1son,2002;Eriksen et a1.,2004;Pestka and Smo1inski,2005;Rocha et a1.,2005;Stark,2005;Zhou et a1.,2005a)

1 嘔吐毒素的污染狀況

1.1 世界范圍內(nèi)的污染情況

據(jù)報道，全球生產(chǎn)的飼料中至少25%污染了已知的霉菌毒素。聯(lián)合國糧農(nóng)組織估算，全世界由于霉菌毒素污染造成的損失，每年達(dá)數(shù)千億美元，而對人畜引起的危害更是難以統(tǒng)計。（計成,2008，2009）。

BIOM IN GmbH與新加坡羅馬實(shí)驗室(Romer Labs Singapore Pte Ltd.)從2007年10月至2008年9月合作實(shí)施霉菌毒素普查項目，共進(jìn)行了5192項對農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)來說最重要的幾種霉菌毒素--黃曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZON)、嘔吐毒素(DON)、煙曲霉毒素B1(FUM)和赭曲霉毒素A(OTA)的檢測。分析的樣品有玉米、小麥、大米，有加工副產(chǎn)物如豆粕、玉米蛋白粉、DDGS，以及一些草料如秸稈、青貯和全價料，總數(shù)為1086份。結(jié)果顯示，所有的檢測樣品中，AfB1、ZON、DON、FUM 和 OTA的陽性污染率分別為31%、46%、54%、54%和19%。所分析樣品的50%來源于北亞區(qū)域，而且大多數(shù)來源于中國大陸。與上年度相似，北亞區(qū)樣品中DON的發(fā)生率非常高，76%的樣品呈陽性(平均含量873ppb)。本次普查所發(fā)現(xiàn)的最高DON含量(32893ppb)樣品為來源于中國的全價料樣品。（DI Ines Rodrigues.2009）

值得我們關(guān)注的是，近年來，玉米作為原料發(fā)酵酒精的用量越來越大，隨之產(chǎn)生的大量的副產(chǎn)品蒸餾干燥玉米酒糟(DDGS)，也正在被普遍的應(yīng)用到飼料中，然而，霉菌毒素污染成為使用DDGS的巨大障礙，這是因為酒精發(fā)酵的過程不但不會破壞霉菌毒素，最終的DDGS反而會使霉菌毒素濃縮2～3倍。 （Zhou,2007,內(nèi)部資料）

1.2 中國嘔吐毒素污染現(xiàn)狀：

農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心 (成都)2008年從全國七大區(qū)域中選擇一些有代表性的省份(遼寧，河北，河南、湖南，廣東，福建、江西、山東，四川、貴州以及陜西)的飼料和養(yǎng)殖企業(yè)采集了7種主要飼料原料(玉米、豆粕、菜粕、棉粕、小麥、小麥麩、魚粉)及2種主要配合飼料，共計1018個樣品。嘔吐毒素平均檢出率為95.8%，超標(biāo)率呈現(xiàn)北高南低的趨勢，平均為18.7%。

表1 我國主要飼料原料及產(chǎn)品中嘔吐毒素污染情況與分布規(guī)律

國家糧食局標(biāo)準(zhǔn)檢測中心2009年6月對河南、湖北兩省13個地市的小麥400份樣本檢測。黃曲霉毒素檢出率18.3%，未超標(biāo)。嘔吐毒素檢出率46%，其中16.2%超標(biāo)，玉米赤霉烯酮檢出率37.1%，其中12.4%超標(biāo)。

2 嘔吐毒素的生物降解

目前為止，沒有更有效的方法解決霉菌毒素污染的問題，常用的脫毒方法是將污染的飼料原料按照比例稀釋或向飼料中添加霉菌毒素吸附劑（沸石或者膨潤土）。但是這些方法都存在著各自的缺陷。稀釋法容易造成二次污染，吸附法的缺點(diǎn)是吸附劑沒有選擇性，而且對營養(yǎng)物質(zhì)的吸附要大于霉菌毒素。通常，吸附方法對那些具有極性基團(tuán)并且其極性基團(tuán)處于適當(dāng)位置，很容易被吸附的霉菌毒素有效（黃曲霉毒素）。但是，很多毒素比如單端孢菌霉烯毒素(嘔吐毒素、T-2毒素等)、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素等，不能被完全吸附。此外，吸附脫毒的效率很大程度上取決于環(huán)境pH值。

生物降解由于其有效性、針對性和環(huán)境友好性，將是未來霉菌毒素脫毒的一種趨勢。酶解脫毒是控制飼料霉菌毒素風(fēng)險的有效方法，可以解除很多不能被吸附脫毒的霉菌毒素。通過使用酶或者活菌(產(chǎn)生脫毒的酶)來改變毒素的結(jié)構(gòu)，將毒素轉(zhuǎn)化成為對動物無毒的物質(zhì)。

目前，有關(guān)黃曲霉毒素生物降解的研究相對較多。劉大嶺，姚冬生等人1997年發(fā)現(xiàn)從真菌假密環(huán)菌(Armi11arie11a tabescens)中提取的粗酶液可使樣品中的黃曲霉毒素含量減少80%。證明了起解毒作用的是一種胞內(nèi)酶，該酶催化溫度20～30℃，解毒后產(chǎn)物無毒，Km值為2.16×10-6mo1/L。隨后，他們從該真菌的菌絲提取物中分離純化出此解毒酶團(tuán)，克隆得到其基因序列并成功轉(zhuǎn)化到畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，還對該酶的固定化技術(shù)進(jìn)行了研究。

計成的研究小組2006年開始應(yīng)用香豆素從動物糞便、發(fā)霉糧食和飼料、土壤等54個樣品中得到199株細(xì)菌，再用黃曲霉毒作底物進(jìn)一步篩選，得到26株有降解活力的菌株，對其中降解活性大于75%的9株菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和16SrDNA鑒定。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)一種能夠降解黃曲霉毒素的新型活性蛋白-黏細(xì)菌黃曲霉毒素解毒酶，并證明是一種胞外酶。目前，黃曲霉毒素生物降解的研究還存在諸多需要解決的問題，如酶解后產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)還不明了，無法定性黃曲霉毒素解毒酶的解毒效率，生物發(fā)酵法生產(chǎn)的解毒酶的活性不高等問題。微生物降解嘔吐毒素早在1960's被發(fā)現(xiàn) (Horvath and Varga,1961)，此后，從動物腸道、土壤和植物等不同來源得到的的微生物混合物被證明能夠降解霉菌毒素 (Yoshizawa et a1.,1983;Kiess1ing et a1.,1984;Swanson et a1.,1988;Beeton and Bu11,1989;He et a1.,1992; Ko11arczik et a1.,1994;Matsushimaet a1.,1996;Vo1k1 et a1.,2004)。Zhou（2007）總結(jié)了歷年來所有能夠降解嘔吐毒素的微生物種類（表2）。

嘔吐毒素DON可以被微生物降解成毒性很低的化合物，12，13-環(huán)氧基團(tuán)是嘔吐毒素的毒性結(jié)構(gòu)，去除這種環(huán)氧基團(tuán)就能顯著降低其毒性，比如DON 就可 以降 解為 DOM-1（圖 3， 圖 4）。Yoshizawa等在小鼠的尿液和糞便中發(fā)現(xiàn)，嘔吐毒素的環(huán)氧基團(tuán)在酶的作用下發(fā)生去環(huán)氧化反應(yīng)，生成二烯。但是此項研究進(jìn)展一直是很艱難的，原因是很少有人分離出具備解毒活性的單獨(dú)菌株。Binder等在2000年提純出能夠?qū)I吐毒素的環(huán)氧結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的細(xì)菌品系，他們從瘤胃內(nèi)容物中分離到能夠?qū)I吐毒素進(jìn)行轉(zhuǎn)化脫毒的混合活菌群，進(jìn)一步分離出所需要的菌株，命名為BBSH797。但是據(jù)后來Zhou等對該產(chǎn)品的評價表明（內(nèi)部資料），該產(chǎn)品的解毒作用不理想，原因可能是因為微生物來源于瘤胃，不適合于在家禽和豬的腸道中生長。最近Zhou等改進(jìn)分離方法，再次確認(rèn)嘔吐毒素可以被家禽腸道微生物所降解(Gong et a1.2003;Zhou et a1.2005b)，并成功分離到能夠降解嘔吐毒素的菌株。近幾年，分離能夠降解嘔吐毒素的微生物細(xì)胞或者酶引起了科學(xué)家的興趣，關(guān)舒等（2009）從catfish的腸道內(nèi)分離到降解嘔吐毒素的菌株C133，該菌株在低溫環(huán)境4～25°C下活性最高，活性最適pH范圍是4.5～10.4。Hai等（2010）采用常規(guī)分離和PCR-DGGE相結(jié)合的方法，從蛋雞的腸道內(nèi)分離出能夠降解嘔吐毒素的菌株。目前，進(jìn)一步的研究集中在降解嘔吐毒素的解毒酶的分離和純化方面，以及尋找產(chǎn)解毒酶基因，然后將目的基因克隆到生物表達(dá)其中高效表達(dá)，這將是今后一段時間霉菌毒素生物降解的研究方向。

圖3 .嘔吐毒素 Vom itoxin被微生物轉(zhuǎn)化成毒性很低的毒素de-epoxy vom itoxin (DOM-1)（Gong,2003）。

表2 能夠降解嘔吐毒素的微生物/混合物（Zhou,2007）

圖4 .HPLC檢測嘔吐毒素降解前后產(chǎn)物圖譜

近年來，霉菌毒素污染對畜牧生產(chǎn)的負(fù)面影響逐漸被人們認(rèn)識，尤其是嘔吐毒素在我國谷物及飼料產(chǎn)品中檢出率和超標(biāo)率都居高不下，是我國北方糧食主產(chǎn)區(qū)的主要污染毒素。國外對于嘔吐毒素的研究剛剛起步，在中國，還沒有見到嘔吐毒素降解菌以及解毒酶相關(guān)的研究報道，篩選出能夠產(chǎn)高效降解嘔吐毒素酶的菌株以及通過酶工程、基因工程等手段獲得高效表達(dá)的解毒酶是當(dāng)前研究的方向。參考文獻(xiàn)(略)