亮氨酸對(duì)肉雞腸上皮細(xì)胞TOR基因表達(dá)調(diào)控的研究

王瑞賀 李然 韓靜婭 史衛(wèi)平 丁顯濤 劉寧

河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471003

雷帕霉素靶蛋白(Target of Rapamycin，TOR)是一類進(jìn)化上十分保守的Ser/Thr蛋白激酶，屬于磷酸肌醇相關(guān)激酶家族成員，廣泛存在于各種生物細(xì)胞中。TOR也是一種重要的信號(hào)分子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期中起到中樞作用。它能夠激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，通過(guò)4E-BP1、S6K等翻譯調(diào)節(jié)因子的磷酸化作用來(lái)傳遞外界營(yíng)養(yǎng)狀況、生長(zhǎng)因子等信號(hào)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)核糖體的發(fā)生、蛋白質(zhì)的合成等生理過(guò)程，進(jìn)而綜合調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡和自噬。TOR信號(hào)是營(yíng)養(yǎng)、化學(xué)和運(yùn)動(dòng)等因素導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)，生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)素、能量、應(yīng)激以及雷帕霉素(Rapamycin)等因素可以調(diào)控TOR信號(hào)活性。

氨基酸通過(guò)TOR信號(hào)調(diào)控蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)，是最重要的功能性營(yíng)養(yǎng)素，尤其亮氨酸(Leu)在蛋白翻譯起始和刺激蛋白質(zhì)的合成中起著獨(dú)特的作用，可激活新生動(dòng)物骨骼肌TOR，但其對(duì)蛋白質(zhì)合成的激活作用還依賴于其它氨基酸的有效性。腸上皮細(xì)胞(Intestina1 Epithe1ia1 Ce11，IEC)在營(yíng)養(yǎng)素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)以及營(yíng)養(yǎng)與生長(zhǎng)信號(hào)整合方面發(fā)揮著重要作用，而關(guān)于Leu對(duì)IEC中TOR信號(hào)活性的影響缺乏報(bào)道。本文旨在研究不同濃度亮氨酸對(duì)體外培養(yǎng)的肉雞IEC中TOR信號(hào)mRNA表達(dá)的影響，為探討氨基酸調(diào)控蛋白質(zhì)合成的作用機(jī)制及建立精確的營(yíng)養(yǎng)供給技術(shù)提供理論基礎(chǔ)和開創(chuàng)性思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DMEM培養(yǎng)基、TRIZOL試劑購(gòu)自Gibco(美國(guó))；胰蛋白酶、EDTA、亮氨酸購(gòu)自 Sigma(美國(guó))；同胎牛血清(FBS)購(gòu)自 At1anta Bio1ogica1s(美國(guó))；RT-PCR試劑盒購(gòu)自Fermentas，其余試劑均為分析純。CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒公司 (BPN-150CRH 中國(guó))，PCR儀Techne(TC-412 英國(guó))。

1.2 細(xì)胞分離與培養(yǎng)

選用發(fā)育正常的18日齡AA肉雞胚胎20枚，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)各組分別包括5枚雞胚，無(wú)菌摘取腸道組織，分別分離并鑒定IEC。IEC細(xì)胞在37℃、10%CO2、90%O2、90%相對(duì)濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM，給予10%小牛血清，100U/m1青霉素，100U/m1鏈霉素。對(duì)照組不含 Leu(0mM)、 實(shí)驗(yàn) I、II、III和 IV 組分別含 Leu 50mM、100mM、150mM和200mM。原代IEC細(xì)胞與對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組在37℃條件下共孵育2h(n=5)后，收集細(xì)胞。

1.3 RT-PCR擴(kuò)增

對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行總RNA抽提，并紫外分析檢測(cè)所抽提RNA的純度。根據(jù)Genbank登錄的雞TOR基因和雞β-actin基因?yàn)槟０澹捎肞rimer prem ier軟件設(shè)計(jì)引物 (表1)。采用兩步法RTPCR：(1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得細(xì)胞cDNA；(2)PCR反應(yīng)，采用內(nèi)對(duì)照β-actin和目的基因TOR特異性引物，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，照相。以β-actin為內(nèi)參，對(duì)各組基因擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶進(jìn)行光密度掃描。

表1 基因擴(kuò)增的引物信息

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

定量數(shù)據(jù)為TOR基因與β-actin基因表達(dá)量的比值，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩組間多重比較采用鄧肯氏檢驗(yàn)。采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P﹤0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，電泳圖條帶清晰，實(shí)驗(yàn)II組(Leu，100mM)和III組亮度高，實(shí)驗(yàn) I組(Leu，50mM)和 IV 組(Leu，200mM)條帶亮度較低，對(duì)照組條帶幾乎看不到，表明實(shí)驗(yàn)II組和III組雞胚IEC中TOR基因mRNA表達(dá)豐度較高，而實(shí)驗(yàn)I組和IV組表達(dá)量較低。

根據(jù)雞TOR基因mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶的光密度和內(nèi)標(biāo)基因β-actin光密度的比值，得到TOR基因mRNA表達(dá)的相對(duì)量，見圖2。實(shí)驗(yàn)組Leu表達(dá)量相對(duì)比值均顯著高于對(duì)照組(P﹤0.05)。4個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，II組和III組顯著高于I組和IV組(P﹤0.05)，但I(xiàn)I和III組之間差異不顯著 (P≥0.05)。說(shuō)明Leu能顯著提高雞IEC中TOR基因表達(dá)，以100mM和150mM效果最好。

圖2 Leu對(duì)雞胚IEC中TOR與β-actin基因比值的影響，實(shí)驗(yàn)I-IV組Leu濃度分別為50mM、100mM、150mM、200mM

3 討論

動(dòng)物對(duì)生長(zhǎng)信號(hào)和營(yíng)養(yǎng)感應(yīng)是通過(guò)一系列信號(hào)途徑來(lái)整合的，其中TOR信號(hào)是最重要的細(xì)胞信號(hào)，該信號(hào)是在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白合成的中樞。TOR根據(jù)細(xì)胞環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)條件做出相應(yīng)的應(yīng)答，參與調(diào)控蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的活性，從而控制與蛋白質(zhì)合成和基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因的表達(dá)。外界營(yíng)養(yǎng)條件如碳源和氮源能刺激細(xì)胞的生長(zhǎng)。在TOR作用條件下，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或其他的生長(zhǎng)刺激出現(xiàn)時(shí)，細(xì)胞主動(dòng)上調(diào)大分子物質(zhì)的合成，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；相反地，為適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)限制或其他應(yīng)激，細(xì)胞能夠抑制大分子物質(zhì)的合成和提高物質(zhì)周轉(zhuǎn)量。

營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)TOR活性具有顯著的上調(diào)作用，而抗?fàn)I養(yǎng)因子對(duì)其具有下調(diào)作用。Du et a1.(2005)發(fā)現(xiàn)對(duì)奶牛限飼降低了骨骼肌細(xì)胞中TOR信號(hào)活性。Liu et a1.(2008)報(bào)道植酸顯著下調(diào)了TOR在肉雞小腸中的mRNA表達(dá)，表明植酸降低了細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)信號(hào)、蛋白合成以及細(xì)胞生長(zhǎng)。Leu在蛋白翻譯起始和刺激蛋白質(zhì)的合成中發(fā)揮著重要作用。W i1son等(2010)研究表明長(zhǎng)期靜脈注射Leu激活了新生動(dòng)物骨骼肌TOR，但其對(duì)蛋白質(zhì)合成的激活作用還依賴于氨基酸的有效性。

IEC起源于腸上皮干細(xì)胞的分化，腸上皮干細(xì)胞位于陷窩基底部，是一類具有自我更新、高度增殖、不對(duì)稱性分裂和多向分化潛能的細(xì)胞。IEC是腸道內(nèi)主要的功能細(xì)胞，參與腸道食物的消化、吸收及內(nèi)外分泌，構(gòu)成體內(nèi)的免疫屏障，調(diào)控體內(nèi)免疫水平，并阻止微生物及毒素對(duì)腸道的侵襲。因此，促進(jìn)IEC的分裂增殖，在維持腸道粘膜正常結(jié)構(gòu)、功能和代謝等方面具有重要的作用。但是，關(guān)于營(yíng)養(yǎng)介導(dǎo)的IEC中TOR信號(hào)活性的研究尚無(wú)報(bào)道。本研究中，Leu顯著提高了TOR基因在體外培養(yǎng)IEC中的表達(dá)，表明Leu促進(jìn)了IEC的分裂增殖，并且培養(yǎng)液中Leu的最佳濃度為100～150mM。但是，由于體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性，該濃度范圍在體內(nèi)研究中是否具有類似效果，值得進(jìn)一步研究。另外，Leu與腸道的功能物質(zhì)谷氨酰胺和以小腸為主要代謝場(chǎng)所的精氨酸之間是否具有互作效應(yīng)也值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

Leu具有顯著提高TOR基因在體外培養(yǎng)IEC中的表達(dá)作用，表明Leu能夠促進(jìn)IEC的分裂增殖，其中Leu在培養(yǎng)液中的最佳濃度為100～150mM。

（略）