骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性的研究進(jìn)展*

邴愛英 宋文剛

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) 亦稱骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)，是主要存在于機(jī)體骨髓腔中的一種干細(xì)胞, 在一定的誘導(dǎo)條件下, 可分化為多種胚層細(xì)胞[1-2]，更重要的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能, 進(jìn)行異體移植時(shí)可避免免疫排斥反應(yīng)[3], 故對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究越來越受到廣泛的關(guān)注。

20世紀(jì)70年代中期，F(xiàn)riedenstein等首次報(bào)道，骨髓標(biāo)本中小部分貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)過程中能夠分化形成類似骨、軟骨的集落，并將之稱為骨髓多能間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow pluripotent stromal cells)，又稱BMSCs。1997年，Prockop成功分離出BMSCs，發(fā)現(xiàn)其具有多向分化潛能，可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞和成肌細(xì)胞等。近年來，人們在研究中建立了人、猴、兔、大鼠等不同種屬BMSCs的培養(yǎng)體系，其取材部位及方式等各有不同。

1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

BMSCS的含量很低，約占骨髓有核細(xì)胞的0.001%～0.010%左右，并且隨著年齡增長遞減，要利用BMSCS就必須實(shí)現(xiàn)BMSCS的體外分離培養(yǎng)和擴(kuò)增。目前對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)還沒有統(tǒng)一的方法，現(xiàn)在較為常用的分離方法主要有：貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀和免疫磁珠分離法。前兩種方法獲得的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成分復(fù)雜，純度不夠高。而用流式細(xì)胞儀和免疫磁珠分離技術(shù)雖然可獲得高純度的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但對細(xì)胞活性和分化能力有較大影響，而且實(shí)驗(yàn)條件要求高，需要骨髓量較大。目前最常用的是貼壁篩選法與密度梯度離心法相結(jié)合的方法，既可以增加分離BMSCs的純度，又避免影響B(tài)MSCs的活性，而且操作簡便，成本不高[4]。

1.1貼壁篩選法 貼壁篩選法是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞最初的分離培養(yǎng)方法，是由Friedenstein在19世紀(jì)70年代中期建立的。它是根據(jù) BMSCs在塑料培養(yǎng)瓶中貼壁生長的特性，通過定期換液除去不貼壁細(xì)胞，從而達(dá)到分離、純化BMSCs的目的。Friedenstein等的工作創(chuàng)建了一種體外分離和培養(yǎng)的簡便可行的方法。至今該方法仍是一種得到廣泛應(yīng)用的經(jīng)典途徑。

1.2密度梯度離心法 梯度離心法的核心主要是基于密度梯度離心技術(shù)。梯度離心法是根據(jù)骨髓中細(xì)胞成分的比重不同，使用淋巴細(xì)胞分離液提取單個(gè)核細(xì)胞，再進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，從而達(dá)到分離、純化BMSCs的目的。Pittenger等的研究發(fā)現(xiàn)通過密度梯度離心分離培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞在第一代時(shí)純度可以達(dá)到95%。

1.3流式細(xì)胞儀和免疫磁珠法 常用方法為免疫磁珠法，是利用免疫學(xué)的技術(shù)分離BMSCS，分離細(xì)胞的純度高。 Phinney[5]用一種免疫耗損技術(shù)精確地將造血細(xì)胞系和內(nèi)皮細(xì)胞系從基質(zhì)細(xì)胞中分離出來，提供了一種能高效的分離純化間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，但目前仍未篩選到真正特異性的細(xì)胞表面標(biāo)記；而且，這兩種分離方法的操作對細(xì)胞活性都有較大影響，造成BMSCS損傷，出現(xiàn)增殖緩慢等問題，這些技術(shù)問題很大程度上限制了這兩種方法的應(yīng)用。因此，如何能簡便高效地獲得均質(zhì)性的間充質(zhì)干細(xì)胞和細(xì)胞群仍需要繼續(xù)探索。

1.4BMSCs 的培養(yǎng)、擴(kuò)增 最常用的是LG-DMEM 培養(yǎng)基，含體積分?jǐn)?shù) 10%～20%的胎牛血清，其中體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清最有利于 BMSCs的貼壁、擴(kuò)增及多系潛能的維持，體積分?jǐn)?shù)過高時(shí)，血清中含有大量促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的因子，容易使細(xì)胞過早出現(xiàn)老化。但如果BMSCS要應(yīng)用于臨床治療，則BMSCS應(yīng)盡量避免和胎牛血清或新生牛血清的接觸，以避免污染瘋牛病毒和異體蛋白增加的過敏風(fēng)險(xiǎn)。目前已有多項(xiàng)研究使用臍帶血血清或人自體血清替代胎牛血清用于BMSCs的培養(yǎng)，這樣既可以避免上述風(fēng)險(xiǎn)，又因此類血清中含多種細(xì)胞因子，可促進(jìn)BMSCs的增殖、分化，因此為臨床提供了一種安全有效的培養(yǎng)方法。此外，種植密度、氧體積分?jǐn)?shù)及細(xì)胞因子都對 BMSCs的培養(yǎng)有一定影響，Lennon 等認(rèn)為低密度種植有益于細(xì)胞擴(kuò)增，氧體積分?jǐn)?shù)低于20%有利于干細(xì)胞功能的存留，血小板衍生生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子亦有較強(qiáng)的促進(jìn)增殖作用。

2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性

骨髓基質(zhì)是骨髓腔中為造血干細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)和功能支持的結(jié)締組織，由基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞間基質(zhì)構(gòu)成。BMSCS主要有如下特性：①形態(tài)學(xué)特征；②具有自我復(fù)制、增殖能力；③間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原標(biāo)記；④具有多向分化的能力。

2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征

體外培養(yǎng)的BMSCS體積小，成梭形或多角形，核漿比大，多為平行排列生長或漩渦狀生長，部分貼壁細(xì)胞可以快速形成集落，一些呈典型的紡錘形樣的BMSCS 增殖迅速，形態(tài)均一。細(xì)胞傳代后，傳代細(xì)胞較原代細(xì)胞的貼壁速度快，細(xì)胞傳到第3代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)比較一致。

在光鏡和相差顯微鏡下，BMSCS 為長梭形，類似成纖維細(xì)胞外觀。透射電鏡下BMSCS可表現(xiàn)為兩種不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)類型：一種是處于相對靜息狀態(tài)的細(xì)胞，核較大，核質(zhì)比大，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器少；另一種是處于相對活躍期細(xì)胞，細(xì)胞體積大于前者，核不規(guī)則，含2～3個(gè)核仁，核質(zhì)比小，胞質(zhì)中有豐富的細(xì)胞器。

2.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自我復(fù)制、增殖能力

BMSCS在體外培養(yǎng)條件下生長與其它細(xì)胞一樣，經(jīng)歷生長滯緩期、對數(shù)增殖期和生長平臺(tái)期。對細(xì)胞周期的研究顯示，只有 10% 的BMSCS復(fù)制活躍 ，而大多數(shù)細(xì)胞處于G0/G1期，高比例的G0/G1期細(xì)胞暗示BMSCS具有高度的分化潛能[6]。BMSCS能在體外多次傳代仍保留其染色體核型和端粒酶活性。Conget等對培養(yǎng)條件下BMSCS 的生長增殖進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)成體BMSCS可以在體外分裂(38±4)次，并且保持紡錘形態(tài)和成骨潛能直至細(xì)胞衰竭。細(xì)胞進(jìn)行冷凍復(fù)蘇后培養(yǎng)可傳代達(dá)15次，細(xì)胞的增殖分化潛能未受影響。作為組織工程種子細(xì)胞，必須攜帶正常且完整的遺傳信息，多次傳代后這些遺傳信息沒有改變。

2.3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記

與造血干細(xì)胞不同，BMSCS的表面抗原并沒有確定。已有數(shù)個(gè)抗體被用來鑒定BMSCS，Stro-1 陽性細(xì)胞具有多向分化能力，但是Hung等的研究提示體外擴(kuò)增的Stro-1陰性的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞同樣具有多向分化能力。單克隆抗體SH2和SH3被認(rèn)為是對人BMSCS比較特異的標(biāo)記，SH2抗體認(rèn)為是對應(yīng)于細(xì)胞表面的CD105抗原決定簇，SH3抗體對應(yīng)于CD73。但是在Lee研究中，分離獲得的BMSCS具有典型的自我增殖和多向分化特性，但CD105標(biāo)記都為陰性。至今仍沒有特異的標(biāo)記物來鑒定BMSCS類細(xì)胞，比較一致的看法是，對于所分離的BMSCS進(jìn)行其表面抗原檢測的意義，僅僅在于判斷所獲得的細(xì)胞的純度或均一性，或是初步判斷其為不同于骨髓造血干細(xì)胞的一類細(xì)胞，即骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[7]。

2.4骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化

大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，BMSCS具有多向分化潛能，在不同的微環(huán)境下可向不同的組織細(xì)胞分化。比如，在培養(yǎng)基中加入適量的DXM、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸可誘導(dǎo)BMSCS向成骨細(xì)胞分化[8]；而加入適量的DXM、人胰島素、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤、消炎痛等可誘導(dǎo)BMSCS向脂肪細(xì)胞分化[9]；另外，在特定的微環(huán)境下尚可誘導(dǎo)BMSCS向成軟骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、 神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞等三個(gè)胚層的組織細(xì)胞分化[10-12]。但是誘導(dǎo)分化出的細(xì)胞在體內(nèi)是否能有效的歸巢到特定部位，并發(fā)揮有效的生理功能尚待更多的證據(jù)進(jìn)一步研究。

3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

BMSCs的鑒定問題是目前的難點(diǎn)之一，其原因主要在于對BMSCs的特異性表面標(biāo)記物仍存在爭議。在體外BMSCs以易于貼附于塑料培養(yǎng)板為特征，未分化的基質(zhì)細(xì)胞呈梭形或成纖維細(xì)胞形。通常采用其特征性的形態(tài)以及分化為其它基質(zhì)細(xì)胞系的功能來鑒定。

國際間充質(zhì)及組織干細(xì)胞委員會(huì)于2006年對人來源MSCs實(shí)驗(yàn)研究提出三條最低鑒定標(biāo)準(zhǔn)[13]：①在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，MSCs必須具備對塑料底物的貼附特性；②通過流式細(xì)胞儀檢測，MSCs群體表達(dá) CD105、CD73及CD90陽性率≥95%，且CD45、CD34、CD14或 CD11b、CD79a或 CD19、HLA-DR陽性率表達(dá)≤2%；③經(jīng)體外誘導(dǎo)，MSCs 必須能向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化。比較公認(rèn)的鑒定標(biāo)志是BMSCs 既不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原CD34、CD45、CD14、CD38，也不表達(dá)淋巴細(xì)胞表面抗原CD11a、CD11b，但表達(dá)許多粘附分子CD44、CD166、CD29等，同時(shí)表達(dá)一些基質(zhì)細(xì)胞表面抗原CD105(SH2)、CD73(SH3、SH4)以及一些細(xì)胞因子受體IL-1R、IFN-γR、TNF-α，BMSCs表達(dá) HLA-Ⅰ類抗原，基本不表達(dá) HLA-Ⅱ 類抗原[14-17]。SH2和SH3為BMSCs相對特異性抗原，但其單抗來源困難，尚不能作為BMSCs常規(guī)檢測指標(biāo)。目前鑒定BMSCs主要依賴其形態(tài)及功能特征。

4 應(yīng)用前景

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類獨(dú)特的干細(xì)胞，具有非常強(qiáng)的自我增殖能力和分化的多潛能性，可以被誘導(dǎo)分化成各種間充質(zhì)組織，包括骨、軟骨、肌肉、神經(jīng)、血管內(nèi)皮等細(xì)胞。由于其多向分化的潛能，兼有易于獲得，對機(jī)體損傷小及體外擴(kuò)增能力強(qiáng)的特點(diǎn)，BMSCs是組織工程理想的種子細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景[18-20]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)的建立有利于進(jìn)一步研究其移植及分化機(jī)制，具有良好的應(yīng)用前景。

體外培養(yǎng)的BMSCs具有多向分化潛能，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，把BMSCs植入體內(nèi)不同組織內(nèi)，可分化出多種不同組織細(xì)胞，表現(xiàn)出相應(yīng)組織細(xì)胞的表型和功能，具有治療相應(yīng)組織臟器疾病潛在價(jià)值。諸多研究證實(shí)其在治療骨軟骨缺損、心臟疾病、血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值，是目前研究最廣泛的細(xì)胞之一[21-23]。

5 存在的問題

目前對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的認(rèn)識(shí)和了解還在初步階段, 很多實(shí)驗(yàn)也表明間充質(zhì)干細(xì)胞具有其它細(xì)胞難以比擬的優(yōu)點(diǎn), 因此人們已迫不及待地把這些細(xì)胞運(yùn)用于心血管疾病、血液系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及外科損傷等領(lǐng)域的治療。但是在許多具體應(yīng)用過程中還有很多問題有待研究，例如：①尋找和鑒定BMSCs所特有的細(xì)胞表面標(biāo)志分子。②對間充質(zhì)干細(xì)胞本身特性的研究，包括它的真正起源、如何能夠快速獲得純的間充質(zhì)干細(xì)胞等，尚需進(jìn)一步研究。③體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化效率不高。④間充質(zhì)干細(xì)胞的相互作用，如間充質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞間相互作用、間充質(zhì)干細(xì)胞與不同成熟階段的細(xì)胞相互作用直接對其生長、分化產(chǎn)生的影響等，都需要進(jìn)行更深一步的研究和探索。

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