應(yīng)激及其損傷時(shí)HSP70表達(dá)及調(diào)控機(jī)制

柳迎華，付青姐，李明春

應(yīng)激反應(yīng)及應(yīng)激保護(hù)是近年來(lái)應(yīng)激損傷領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的，在進(jìn)化上高度保守的蛋白家族。由應(yīng)激誘導(dǎo)的熱休克蛋白可以保護(hù)細(xì)胞免受由應(yīng)激所致的損傷。在細(xì)胞受到應(yīng)激刺激或其損傷時(shí)，能夠迅速合成，對(duì)生物體細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。HSPs家族按其分子量及等電點(diǎn)可分為五個(gè)家族：低分子量HSP家族，中等分量HSP家族，HSP70家族，HSP90家族以及HSP110家族[1]。其中HSP70家族是結(jié)構(gòu)上最為保守，對(duì)應(yīng)激最為敏感的一類(lèi)，被稱(chēng)為主要熱休克蛋白，是HSPs家族中研究最為廣泛，最深入的一種。

1 HSP70的結(jié)構(gòu)特征

1.1 HSP70的分類(lèi) HSP70是一類(lèi)分子量在66～80 kD的熱休克蛋白，它們的分子量相近，等電點(diǎn)為pH5.2～6.3。HSP70家族在結(jié)構(gòu)上高度保守，主要包括四種蛋白：HSP72、HSP73、HSP75、HSP78。 HSP72 為 誘 導(dǎo) 型 HSP70 （induced HSP70），在正常細(xì)胞中通常不表達(dá)或表達(dá)較少，在熱及其它應(yīng)激原作用下表達(dá)迅速增加。HSP73為結(jié)構(gòu)型HSP70（constitutive HSP70），也稱(chēng)熱應(yīng)激同源蛋白70（heat shock cognate 70），在所有的細(xì)胞內(nèi)均能表達(dá)且受熱誘導(dǎo)，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白。HSP75，主要定位于線粒體內(nèi)，參與細(xì)胞內(nèi)合成線粒體蛋白質(zhì)前體的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及進(jìn)入線粒體后的穩(wěn)定和進(jìn)一步折疊。HSP78，也稱(chēng)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和其它生物膜腔，可能與IgG的成熟和許多分泌蛋白分子的組裝有關(guān)。其中，HSP72與HSP73是兩種主要的HSP70。這兩種蛋白的氨基酸序列90%是相同的，它們的生化特性除了電泳動(dòng)泳動(dòng)度稍有差異外，其余大部分特性相同[2]。

1.2 HSP70結(jié)構(gòu)[3]根據(jù)氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)，可將HSP70分為三個(gè)功能域：ATP酶活性區(qū)，也稱(chēng)核苷結(jié)合域（nucleotide biding domain，NBD），由近N端大小為45 kD的氨基酸序列組成，此區(qū)在結(jié)構(gòu)上高度保守。立體結(jié)構(gòu)上NBD由4個(gè)結(jié)構(gòu)亞區(qū)組成2個(gè)相似的葉，結(jié)合并水解ATP。

多肽結(jié)合區(qū)（peptide biding domain，PBD），由 ATP 酶活性區(qū)后大小為15 kD、結(jié)構(gòu)上相對(duì)保守的氨基酸序列組成，在立體結(jié)構(gòu)上PBD包含1個(gè)β-夾層結(jié)構(gòu)亞區(qū)和1個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)亞區(qū)，在2個(gè)結(jié)構(gòu)亞區(qū)間形成多肽結(jié)合袋狀結(jié)構(gòu)，能與底物多肽結(jié)合。

功能不明區(qū)，可能與特定的蛋白底物結(jié)合有關(guān)，包括近C端大小為10 kD的結(jié)構(gòu)多變氨基酸序列。

2 應(yīng)激時(shí)HSP70的生物學(xué)特性

2.1 提高細(xì)胞對(duì)應(yīng)激原的耐受性[4]研究表明，HSP70可提高細(xì)胞對(duì)應(yīng)激原的耐受性。其一，許多耐熱的細(xì)胞株HSP70表達(dá)水平升高，有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)HSP70的生成量與細(xì)胞的耐熱性成正相關(guān)；其二，競(jìng)爭(zhēng)性抑制細(xì)胞內(nèi)HSP70基因表達(dá)或注射HSP70抗體后，細(xì)胞的熱敏感性更高；其三，在一些應(yīng)激原刺激下產(chǎn)生的HSP70，具有保護(hù)組織細(xì)胞免受其它不同應(yīng)激原的損害。

2.2 分子伴侶作用[5-8]目前認(rèn)為，HSP70是主要的伴侶蛋白，其作用是與新生、未折疊、錯(cuò)誤折疊或聚焦的蛋白質(zhì)結(jié)合，使某些蛋白質(zhì)解離，減少產(chǎn)生不溶性聚集物，加速正確的肽鏈折疊，促進(jìn)某些變性蛋白的降解和清除。在多種應(yīng)激情況下，HSP70的合成可增強(qiáng)應(yīng)激細(xì)胞處理非折疊和/或變性蛋白的能力，因而增加了暴露于廣泛致死性刺激下細(xì)胞的存活。

2.3 抗細(xì)胞凋亡作用[9-11]研究表明，細(xì)胞內(nèi)HSP70水平的升高可通過(guò)阻斷信號(hào)通路，抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白激酶38（PK38）和JNK激活，從而減少細(xì)胞凋亡。線粒體可能是細(xì)胞選擇死亡 （炎癥擴(kuò)大）或凋亡 （炎癥受限）的關(guān)鍵細(xì)胞器，HSP70對(duì)線粒體的保護(hù)可能是HSP70的重要的抗凋亡機(jī)制。

2.4 免疫功能 HSP70還有結(jié)合細(xì)胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體，激活蛋白激酶C及蛋白酶活性、ATP水解、生成過(guò)氧化物歧化酶（SOD）等功能，使細(xì)胞自衛(wèi)，并維持其生物學(xué)特性，并參與免疫反應(yīng)和抑制炎癥反應(yīng)。HSP70在受損細(xì)胞表面的表達(dá)可幫助免疫系統(tǒng)識(shí)別清除這些毒性細(xì)胞。HSP70還可以協(xié)助抗原提呈給T細(xì)胞而參與細(xì)胞免疫，抑制IL-1、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）等炎癥介質(zhì)的表達(dá)[12]。

2.5 抗氧化應(yīng)激作用[13]機(jī)體應(yīng)激時(shí)氧自由基生成增多，通過(guò)脂質(zhì)氧化對(duì)生物膜的通透性發(fā)生巨大的影響，對(duì)細(xì)胞及細(xì)胞器造成破壞。HSP70抑制產(chǎn)生氧自由基的關(guān)鍵酶，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，通過(guò)反饋抑制作用減少氧自由基的產(chǎn)生，還可提高內(nèi)源性過(guò)氧化酶水平，從而加快氧自由基的清除。同時(shí)，HSP70還可對(duì)抗H2O2對(duì)細(xì)胞膜的損傷，減少Ca2+細(xì)胞，從而保護(hù)細(xì)胞免受由活性氧族介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流引起的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡。

3 應(yīng)激狀態(tài)下HSP70的表達(dá)與調(diào)控

HSP70基因定位于第6、14、21對(duì)等染色體上，由2 440個(gè)核苷酸組成。其5’端3’端分別含有非編碼的212和242個(gè)核苷酸序列。5’端上游是TATA盒的熱休克元件。人類(lèi)與果蠅的基因序列有72%的同源性，與E.coli有50%的同源性。證明HSP70在進(jìn)化中的高度保守性[14]。人類(lèi)HSP70基因與其它的HSP基因一樣，不含有內(nèi)含子。這與HSP70在應(yīng)激及損傷時(shí)需要迅速表達(dá)相適應(yīng)。HSP70家族的表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。但各項(xiàng)研究表明，HSP70表達(dá)主要與熱休克轉(zhuǎn)錄因子（HSF）以及熱休克轉(zhuǎn)錄元件（HSE）相關(guān)。

3.1 熱休克轉(zhuǎn)錄因子（heat shock factor，HSF） HSF，是一類(lèi)結(jié)構(gòu)和功能具有廣泛同源性，普遍存在于真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。HSF 按其功能分為 HSF1、HSF2、HSF3、HSF4四類(lèi)。 其中HSF1是HSP70表達(dá)的主要調(diào)控因子，HSF1也被稱(chēng)為快速的應(yīng)激反應(yīng)因子[15]。在不同物種中是高度保守的；HSF2主要對(duì)熱反應(yīng)進(jìn)展期的信號(hào)進(jìn)行應(yīng)答；HSF3是鳥(niǎo)類(lèi)特有的熱休克調(diào)控因子；HSF4僅在人體中存在，與白內(nèi)障的發(fā)生密切相關(guān)。不同的HSF介導(dǎo)不同的生理環(huán)境刺激下的應(yīng)答。正常狀態(tài)下，HSF以無(wú)活性的單體形式存在于胞漿中，在應(yīng)激狀態(tài)下，HSF活化作為轉(zhuǎn)錄因子，與HSE結(jié)合，啟動(dòng)HSP70基因的轉(zhuǎn)錄翻譯。

近年來(lái)研究表明，盡管不同物種間HSF存在差別，但基本上都含有四個(gè)結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合區(qū)域 （DNA binding domain，DBD）、三聚區(qū)域（trimerization domain，TD）、調(diào)節(jié)域（regulatory domain，RD）、 轉(zhuǎn) 錄 活 化 域 （transcriptional activation domain，TAD）。HSF1 具有 529 個(gè)氨基酸，在不同的物種中結(jié)構(gòu)高度保守，含有DBD、TD、RD和TAD四個(gè)區(qū)域。DBD、TD是HSF1中結(jié)構(gòu)高度保守的兩個(gè)核心區(qū)域。Bonner等通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，DBD、TD保守序列對(duì)HSP70基因的表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要作用。

位于N端的DBD區(qū)域主要通過(guò)與DNA上的大溝結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)就是DNA上的熱休克元件（heat shock element，HSE）。HSF1能識(shí)別HSE上特異性的“-nGAAn-”結(jié)構(gòu)，并結(jié)合到HSP基因上，誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄。

TD結(jié)構(gòu)域是由三個(gè)疏水七氨基酸重復(fù)序列 （hydrophobic heptad repeats，HR-A/B）的螺旋環(huán)結(jié)構(gòu)形成。HSF1 通常通過(guò)三聚化結(jié)構(gòu)域與其它蛋白或自身相互作用。正常狀態(tài)下，HSF1通過(guò)TD區(qū)域與HSP結(jié)合，以無(wú)活性的單體形式存在。當(dāng)HSF1活化時(shí)，三個(gè)單聚體通過(guò)TD區(qū)域結(jié)合形成具有強(qiáng)大的親和力的三聚體，三聚體結(jié)合到HSPDN上，誘發(fā)轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始。

RD區(qū)被認(rèn)為是人感受熱壓力的關(guān)鍵，主要通過(guò)兩個(gè)特殊絲氨酸/脯氨酸基序使S303和S307進(jìn)行結(jié)構(gòu)性磷酸化，在正常溫度下對(duì)HSF1轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行負(fù)調(diào)控。

TAD區(qū)位于C端，由RD區(qū)結(jié)合，調(diào)節(jié)HSP70基因轉(zhuǎn)錄的活性[16，17]。

3.2 熱休克元件（HSE） HSE是熱休克蛋白基因5號(hào)臂上的一個(gè)特殊的DNA識(shí)別序列，位于HSP70基因啟動(dòng)子TATA盒上游。是一段高度保守的DNA序列。HSE能與HSF1的DBD區(qū)域結(jié)合，募集更多的啟動(dòng)因子，促進(jìn)HSP70基因的轉(zhuǎn)錄[18]。HSE結(jié)構(gòu)主要為nnGAAnnTTCnn，其中nGGAn五核苷酸為核心序列組合，是HSF1在DNA上的結(jié)合位點(diǎn)。

3.3 HSP70家族的基因轉(zhuǎn)錄 HSP70的基因表達(dá)調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其具體機(jī)制尚未完全清楚。目前學(xué)術(shù)界大致存在有以下幾種機(jī)制

3.3.1 應(yīng)激時(shí)變性蛋白與HSF1對(duì)HSP70的競(jìng)爭(zhēng)學(xué)說(shuō) 在正常細(xì)胞中，HSP的表達(dá)很少，HSF1呈單體形式存在。單體HSF1通過(guò)TD區(qū)與HSP70結(jié)合，使得兩者都處于一種無(wú)活性的狀態(tài)。

當(dāng)發(fā)生應(yīng)激及其損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的非穩(wěn)定蛋白、變異蛋白、以及新生和轉(zhuǎn)移的蛋白前體。這些異常蛋白與HSP70的結(jié)合能力強(qiáng)于HSF1，競(jìng)爭(zhēng)性的與HSP70結(jié)合。HSP70發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)變異蛋白進(jìn)行修復(fù)或清除。

同時(shí)游離的HSF1單體增多，通過(guò)TD區(qū)形成三聚體，具有較高的結(jié)合DNA的活性。HSF1形成三聚體后進(jìn)入細(xì)胞核中，使得絲氨酸殘基磷酸化，結(jié)合到HSP基因5’端啟動(dòng)子區(qū)的HSE。HSF1與HSE結(jié)合后，啟動(dòng)HSP70基因的誘導(dǎo)表達(dá)。

HSP70基因表達(dá)，產(chǎn)生大量的HSP70，對(duì)應(yīng)激中的受損變異蛋白及新生蛋白進(jìn)行修復(fù)或清除，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。隨著應(yīng)激反應(yīng)的減弱，細(xì)胞進(jìn)入復(fù)愈階段，對(duì)HSP70的需求減少。此時(shí)，剩余的HSP70又重新結(jié)合到HSF1上，兩者重新形成無(wú)活性單體，HSP70基因轉(zhuǎn)錄停止。

在此過(guò)程中，HSF1對(duì)HSP70的合成起到一個(gè)負(fù)反饋的作用，既保證HSP70的足夠量的表達(dá)，同時(shí)也避免過(guò)多的HSP70的合成，對(duì)機(jī)體造成損傷。是目前較被廣泛認(rèn)同的一種機(jī)制。

此外，Zou等則認(rèn)為，在正常細(xì)胞中，是HSP90與HSF1結(jié)合，抑制了HSF1的活性。當(dāng)應(yīng)激及其損傷發(fā)生的時(shí)候，變性蛋白與HSP90結(jié)合，釋放HSF1。游離的HSF1三聚化之衙，引起 HSP70 基因的轉(zhuǎn)錄[19，20]。

3.3.2 泛素（Ub）學(xué)說(shuō) Munro等認(rèn)為，HSP70的表達(dá)與泛素（Ub）非依賴(lài)性溶酶體蛋白降解系統(tǒng)密切相關(guān)。他們認(rèn)為：在正常情況下，HSF1以無(wú)活性的單體形式呈泛素化狀態(tài)。而在應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量變性蛋白激活了Ub介導(dǎo)的蛋白降解系統(tǒng)，游離的Ub水平下降，與HSF1的結(jié)合減少，致游離態(tài)單體HSF1增多。單體HSF1形成具有活性的三聚體形式，磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與HSE結(jié)合，在RNA聚合酶作用下誘導(dǎo)HSP70基因的轉(zhuǎn)錄。伴隨著變性蛋白大量被水解酶降解，加之細(xì)胞不斷合成新的Ub，HSF重新與Ub結(jié)合，失去活性。終止HSP70基因的轉(zhuǎn)錄[21]。

3.3.3 熱休克因子結(jié)合蛋白學(xué)說(shuō) 也有學(xué)者認(rèn)為，在正常細(xì)胞中，HSF1呈無(wú)活性的單體形式存在。當(dāng)應(yīng)激時(shí)，變性蛋白與HSP70結(jié)合，釋放HSF1。HSF1三聚化后進(jìn)入細(xì)胞核中，磷酸化并結(jié)合到DNA上，誘導(dǎo)HSP70基因的表達(dá)。當(dāng)?shù)鞍妆磉_(dá)足量時(shí)，HSF1的DNA結(jié)合活性減弱，HSBP與HSP70瞬時(shí)發(fā)生相互作用生成HSBP-HSP70復(fù)合物。此時(shí)，伴隨著HSF1三聚體解體為HSF1單體而失活。誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP70與HSF1單體結(jié)合，抑制三聚體的產(chǎn)生，形成一個(gè)明顯的反饋抑制調(diào)節(jié)通路。

4 HSP70的表達(dá)及調(diào)控

HSP70基因轉(zhuǎn)錄之后，形成HSP70mRNA，翻譯形成HSP70蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，在正常情況下HSP70mRNA的半衰期只有15～30 min；而應(yīng)激時(shí)，HSP70mRNA的穩(wěn)定性增強(qiáng)，半衰期可達(dá)4 h，并通過(guò)細(xì)胞內(nèi)存在的識(shí)別HSP70mRNA的5’端前導(dǎo)區(qū)特異異構(gòu)系統(tǒng)，可以選擇性將其翻譯出來(lái)，即通過(guò)增強(qiáng)HSP70mRNA的穩(wěn)定性和優(yōu)先翻譯HSP70mRNA來(lái)緩解應(yīng)激對(duì)機(jī)體的影響[22]。

但有報(bào)道稱(chēng)，HSP70的轉(zhuǎn)錄與翻譯存在著不一致，提示HSP70基因的轉(zhuǎn)錄激活是獨(dú)立于蛋白合成過(guò)程的。有人在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，HSP70mRNA在應(yīng)激狀況下增加，然而HSP70水平卻基本不變。

綜上所述可知，HSP70作為一種在進(jìn)化上高度保守的應(yīng)激蛋白，在機(jī)體應(yīng)激及其損傷中發(fā)揮著重要作用。但其具體的誘導(dǎo)因素是什么？這些應(yīng)激因素是通過(guò)什么途徑對(duì)熱休克蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)？以及HSP70具體的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制如何？等這些都是在基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用中的一系列待以解決的難題。若能更好的將這些問(wèn)題進(jìn)行闡述，可對(duì)HSP70應(yīng)激蛋白進(jìn)行人工誘導(dǎo)，將為創(chuàng)傷、外科手術(shù)或移植等病理生理過(guò)程中細(xì)胞和器官的保護(hù)提供一個(gè)新的有效的途徑。

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