酮病奶牛肝臟脂肪酸代謝研究進展

李鵬 張才龍淼 劉國文 王哲

酮病是高產(chǎn)奶牛在泌乳初期由于能量負平衡所引發(fā)的一種以肝臟脂肪酸氧化代謝紊亂和酮體升高為主要病理特征的圍產(chǎn)期能量代謝障礙性疾病。由于妊娠后期奶牛采食量下降，干物質(zhì)攝入減少，而泌乳初期機體對能量的需求增加，機體處于能量負平衡營養(yǎng)應(yīng)激狀態(tài)，使得這一時期成為酮病的高發(fā)期。能量負平衡必然引發(fā)脂肪動員，從而釋放大量非酯化脂肪酸（NEFA）進入血液，并最終進入肝臟代謝。但目前國內(nèi)外有關(guān)酮病奶牛肝臟脂肪酸氧化代謝狀態(tài)的報道不多，對其主要代謝特點、影響因素和關(guān)鍵環(huán)節(jié)尚不清楚。本文主要對目前有關(guān)酮病奶牛肝臟脂肪酸攝入、脂肪酸的代謝過程及其代謝結(jié)局分別進行闡述。

1 肝臟中脂肪酸的來源

與非反芻動物不同，反芻動物肝臟缺乏脂蛋白脂酶，自身分解甘油三酯而獲得脂肪酸的能力有限。因此，肝臟脂肪酸主要來源于脂肪動員所產(chǎn)生的游離脂肪酸（NEFA）。當(dāng)機體處于能量負平衡狀態(tài)時，脂肪組織大量動員。脂肪分解一方面促進肝臟糖異生作用，以緩解能量虧欠；另一方面必然造成大量的NEFA經(jīng)血液循環(huán)進入肝臟。肝臟攝入NEFA的量與其在血液中的濃度及肝臟的血流速度有關(guān)。有研究表明，血液中7%～25%的NEFA可被肝臟吸收[1]。而肝臟血流速度與奶牛攝入的代謝能成正比，有研究表明，泌乳期奶牛較干奶期奶牛肝臟血流速度高52%，而能量負平衡時血中NEFA濃度增加[2]。因此，血流速率和血中NEFA濃度對于肝臟脂肪酸攝入的影響是相反的，肝臟攝入NEFA的量隨著血液中NEFA的濃度的增加而增加，但血流速度加快可以減少肝臟NEFA的攝入。雖然肝臟血流速度和血液中NEFA濃度均對肝臟脂肪酸的攝入有影響，但NEFA濃度變化的影響要大于血流速度對肝臟脂肪酸攝入的影響。另外，脂肪酸與血清白蛋白的親和力也是決定其攝入的關(guān)鍵因素[21]。

2 脂肪酸氧化代謝

脂肪酸在肝臟的去路主要有兩個：①由β-氧化途徑生成乙酰輔酶A經(jīng)檸檬酸循環(huán)氧化代謝，同時部分氧化生成酮體；②再酯化形成甘油三酯后在肝臟儲存或以脂蛋白形式分泌出肝外。機體完成脂肪酸β-氧化代謝的器官主要有線粒體和過氧化物酶體兩種，二者對于脂肪酸的氧化代謝分別有著各自不同的特點。

2.1 脂肪酸在線粒體內(nèi)的氧化及影響因素

線粒體主要完成≤20個碳原子的脂肪酸代謝。脂肪酸氧化過程主要包括4個步驟：①攝入和活化脂肪酸生成脂酰輔酶A；②脂酰輔酶A轉(zhuǎn)運進入線粒體；③脂酰輔酶A的β-氧化；④酮體生成。肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)可以轉(zhuǎn)運脂肪酸進入線粒體，主要包括3種酶類：CPT-I，肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-I；肉堿脂酰肉堿移位酶；CPT-Ⅱ，肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-Ⅱ。CPT-I位于線粒體外膜，催化脂酰輔酶A和肉堿合成脂酰肉堿并進一步將其轉(zhuǎn)運進入線粒體，是脂肪酸代謝的關(guān)鍵調(diào)控步驟。目前國內(nèi)外對于肝臟脂肪酸代謝的研究多集中在對CPT-I基因表達的調(diào)控上。

脂肪酸在線粒體內(nèi)的氧化代謝主要受CPT-I活性、丙二酰輔酶A濃度和CPT-I對丙二酰輔酶A抑制作用的敏感性的變化三方面影響。雖然CPT-I對于反芻動物肝臟攝入NEFA的量起著關(guān)鍵性的作用，但我們對其表達和調(diào)控作用所知甚少，特別是在圍產(chǎn)期的奶牛。Aiello[3]報道，對從牛和羊肝臟中分離的線粒體的研究表明，其CPT-I的活性可以被丙二酰輔酶A和甲基丙二酸輔酶A所抑制。對小鼠的研究表明，CPT-I表達除了受丙二酰輔酶A濃度變化的影響，CPT-I對丙二酰輔酶A抑制的敏感性也受生理狀態(tài)的調(diào)控。在血液胰島素濃度過低或胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，CPT-I對丙二酰輔酶A的抑制作用敏感性低[4]。小鼠的這些變化的結(jié)果導(dǎo)致CPT-I表達增加，細胞內(nèi)丙二酰輔酶A濃度下降，CPT-I對丙二酰輔酶A的抑制作用的敏感性降低，從而導(dǎo)致酮體生成。但對于奶牛丙二酰輔酶A對CPT-I的抑制濃度尚不清楚。

脂肪酸氧化代謝途徑還受到其它代謝產(chǎn)物和激素的影響。Cadórniga-Valio[5]證實，高濃度BHBA可導(dǎo)致脂肪酸β-氧化和肝臟細胞三羧酸循環(huán)作用降低；而高濃度NEFA促進肝細胞內(nèi)脂肪形成和酮體生成，損壞肝臟脂肪酸代謝功能。Louet[6]的研究表明，長鏈脂肪酸可以提高CPT-I mRNA的表達，促進脂肪酸氧化代謝，而胰高血糖素和甲狀腺素（T3）具有同樣相似的作用，但胰島素的作用則正好相反。而Casta~neda-Guti'errez[20]報道，圍產(chǎn)期奶牛日糧補充飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸并未對產(chǎn)后CPT-I和PPARα mRNA的表達產(chǎn)生顯著影響，并認為圍產(chǎn)期補充脂肪酸并不會對泌乳早期奶牛肝臟脂肪酸代謝產(chǎn)生實質(zhì)性影響。

2.2 脂肪酸在過氧化物酶體內(nèi)的氧化

肝臟NEFA氧化的另一個途徑是過氧化物酶體，而過氧化物酶體是存在于機體大多數(shù)器官的一個亞細胞器。過氧化物酶體中的氧化途徑與線粒體中的相似，主要的區(qū)別是：①氧化的開始步驟受乙酰輔酶A氧化酶催化，生成過氧化氫而不是NAD。相對于線粒體而言，過氧化物酶體中的β-氧化過程消耗較少的能量并釋放更多的熱量。②過氧化物酶體中不包括能生成ATP的呼吸鏈。因此，過氧化物酶體中的β-氧化作用不受細胞能量需求的控制[7]。這種特性使過氧化物酶體的β-氧化作用更適合脂肪酸的部分氧化以及線粒體酶不能氧化的一些外源性復(fù)合物。

在牛肝組織培養(yǎng)物和分離的羊肝細胞中添加四癸基環(huán)氧丙酸（一種CPT-I抑制劑）時，大量NEFA β-氧化作用仍可發(fā)生，表明反芻動物肝臟過氧化物酶體中存在β-氧化作用[8]。隨后的研究表明，在牛肝臟組織勻漿中過氧化物酶體β-氧化作用有充分的活性。對于牛，過氧化物酶體可以氧化總軟脂酸鹽的50%，但在小鼠只有26%，表明過氧化物酶體的β-氧化作用對于反芻動物尤為重要。干奶期飼喂高脂肪日糧，過氧化物酶體的β-氧化作用增強，表明這個途徑在奶牛是可以通過誘導(dǎo)而引發(fā)的，且可能對于圍產(chǎn)期是十分重要的[9]。但目前關(guān)于脂肪酸在過氧化物酶體中氧化代謝的影響因素、調(diào)控機制及其與酮病發(fā)生之間的關(guān)系尚待于進一步研究。

2.3 酮體生成

在非反芻動物，肝臟利用NEFA合成的酮體被用來作為一種能量儲備，在葡萄糖不足的情況下為機體提供能量。盡管奶牛對于葡萄糖的氧化利用普遍低于非反芻動物，但當(dāng)圍產(chǎn)期葡萄糖氧化大量減少時奶牛也可以發(fā)生相似的過程。酮體可以被反芻動物的心臟、腎臟、骨骼肌、乳腺以及胃腸道等組織氧化利用，并可以合成乳脂[12]。因此，圍產(chǎn)期酮體生成增加可能對葡萄糖前體攝入的不足是一種補償。其實反芻動物組織對酮體的利用能力是非常有限的，并最終導(dǎo)致酮體在機體內(nèi)大量蓄積，從而引發(fā)酮病。

肝臟酮體生成過程主要受以下幾個方面的調(diào)控：①肝臟攝入NEFA的量；②CPT-I的活性；③3-羥基-3-甲戊二酰-輔酶A合酶（HMGCoA合酶）[10]的活性。HMGCoA合酶是肝臟酮體生成的關(guān)鍵限速酶，其活性可以受到琥珀酰輔酶A的抑制。因此，對于圍產(chǎn)期奶牛，日糧補充丙酸鹽可以增加線粒體內(nèi)琥珀酰輔酶A的濃度，從而使HMGCoA合酶的活性受到抑制。反之亦然，丙酸鹽的攝入減少可以降低線粒體內(nèi)琥珀酰輔酶A的濃度，從而有利于酮體的生成[11]。而目前關(guān)于圍產(chǎn)期奶牛HMGCoA合酶表達和活性的變化尚不清楚。

對于奶牛酮病的發(fā)病機理，目前普遍認為是由于圍產(chǎn)期能量負平衡導(dǎo)致肝臟糖異生增強，從而使大量草酰乙酸離開三羧循環(huán)而參加葡萄糖合成。線粒體內(nèi)草酰乙酸含量減少，NEFA氧化所產(chǎn)生的大量乙酰輔酶A不能與草酰乙酸結(jié)合而進入三羧酸循環(huán)，最終過量的乙酰輔酶A就會大量生成酮體。隨著對線粒體內(nèi)β-氧化和酮體生成作用的認識不斷加深，這種理論受到了一定的質(zhì)疑。主要是由于幾點原因：①在反芻動物NEFA的氧化速率主要受CPT-Ⅰ的調(diào)控。②在線粒體內(nèi)，草酰乙酸通常都是維持一個較低的濃度，這主要是由于NEFA氧化過程中的高NADH/NAD比率。③NEFA β-氧化的產(chǎn)物乙酰輔酶A是丙酮酸羧化酶（PC）的激活劑，其可以維持線粒體內(nèi)草酰乙酸濃度保持恒定。④不是由于檸檬酸合成所需的草酰乙酸不足，而是由于NEFA氧化過程中的高NADH/NAD比率抑制了檸檬酸循環(huán)中脫氫酶的活性。⑤線粒體內(nèi)琥珀酰輔酶A濃度過低可以活化HMGCoA合成酶而使酮體生成增加。

2.4 甘油三酯合成

反芻動物肝臟用于甘油三酯合成的脂肪酸主要來自于血液循環(huán)中的NEFA。因此，肝臟甘油三酯（TG）合成量與血液循環(huán)中因脂肪動員產(chǎn)生的NEFA的濃度有關(guān)。由于反芻動物肝臟脂肪酸氧化代謝和以極低密度脂蛋白（VLDL）的形式向肝外分泌甘油三酯的能力是有限的，因此，當(dāng)奶牛處于能量負平衡狀態(tài)時，脂肪組織動員，產(chǎn)生的大量游離脂肪酸超過了肝臟輸出或線粒體β-氧化的能力，那么脂肪酸就會以甘油三酯的形式在肝臟中蓄積而引發(fā)脂肪肝。

另外，脂肪酸的酯化速率也是影響甘油三酯合成的主要因素，但對于進入肝臟的脂肪酸是趨向于發(fā)生酯化反應(yīng)還是氧化反應(yīng)及其關(guān)鍵調(diào)控因子目前尚不清楚。Louet[6]指出，當(dāng)細胞外NEFA濃度增加，NEFA在肝細胞內(nèi)發(fā)生酯化反應(yīng)的比例增加。高血糖素和E3并未對肝細胞內(nèi)NEFA發(fā)生酯化反應(yīng)的比例產(chǎn)生影響，但胰島素可以增加NEFA發(fā)生酯化反應(yīng)的比例。Grum[13]研究表明，對照組和在干奶期飼喂高谷物日糧的奶牛產(chǎn)后1 d的肝臟脂肪酸酯化速率是產(chǎn)前21 d的188%，產(chǎn)后21 d的酯化速率是產(chǎn)前的124%。相反，干奶期飼喂高脂日糧的奶牛產(chǎn)后1 d其酯化反應(yīng)速率僅增加7%。酯化能力的變化與產(chǎn)后1 d肝臟中甘油三酯含量正相關(guān)（r=0.44）。這些變化可能是由肝臟脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng)過程中所涉及的關(guān)鍵酶類的表達和活性的改變所決定的。Van報道，與產(chǎn)前相比奶牛產(chǎn)后肝臟中磷脂酸磷酸酶和二?；视王；D(zhuǎn)移酶活性增強，但甘油磷酸?；D(zhuǎn)移酶活性并沒有變化。而脂肪肝奶牛與健康奶牛相比肝臟中磷脂酸磷酸酶和二?；视王；D(zhuǎn)移酶活性并沒有差異，但甘油磷酸?；D(zhuǎn)移酶活性下降[14-15]。

3 脂肪酸氧化代謝與奶牛酮病

肝臟脂肪酸氧化代謝速率直接影響酮體和TG的生成，是控制奶牛酮病等能量代謝障礙性疾病發(fā)生的重要代謝途徑。而目前關(guān)于酮病奶牛肝臟脂肪酸氧化代謝狀態(tài)的報道較少，對其代謝特點及其調(diào)控因素尚不清楚。

Vernon[16]報道指出，奶牛產(chǎn)后酮病的發(fā)生與肝臟脂肪酸氧化代謝過程相關(guān)酶活性變化之間無相關(guān)性。Dann[17]研究表明，圍產(chǎn)期奶牛肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶-I（CPT-I）活性與肝臟總脂、甘油三酯含量、甘油三酯/肝糖原比率和血清非酯化脂肪酸濃度之間正相關(guān)。但原發(fā)性酮病時，CPT-I活性和敏感性并沒有發(fā)生顯著變化，認為CPT-I基因表達和活性變化并不是導(dǎo)致原發(fā)性酮病的主要原因。然而，Murondoti[18]指出，高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后肝臟乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸合成酶和3-羥?；?輔酶A脫氫酶活性顯著降低，導(dǎo)致脂肪酸氧化代謝能力減弱，從而促使脂肪酸β-氧化代謝產(chǎn)物乙酰輔酶A大量生成酮體。認為產(chǎn)后奶牛肝臟脂肪酸氧化代謝能力減弱，可能是引發(fā)奶牛酮病的主要原因。Chuang Xu[19]利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了酮病奶牛肝臟的差異蛋白質(zhì)表達圖譜，發(fā)現(xiàn)參與脂肪酸β-氧化代謝的3-羥?；?輔酶A脫氫酶和參與酮體生成的乙酰輔酶A轉(zhuǎn)乙酰酶在酮病奶牛肝臟中二者表達量均顯著下降，據(jù)此初步推測，奶牛酮病可能存在肝臟脂肪酸氧化代謝能力降低。但就奶牛酮病與肝臟脂肪酸氧化代謝之間的關(guān)系尚有待于進一步研究。

4 結(jié)語

明確酮病奶牛肝臟脂肪酸氧化代謝狀態(tài)，對揭示奶牛酮病的發(fā)生機制和制定有效的防治措施尤為重要。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的不斷發(fā)展，針對酮病發(fā)生機制的研究應(yīng)致力于運用先進的分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)和生物化學(xué)等技術(shù)，從脂肪酸氧化代謝途徑相關(guān)酶類的基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和重要的中間代謝產(chǎn)物水平綜合評價酮病奶牛肝臟脂肪酸氧化代謝特征及其主要制約因素和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為揭示奶牛酮病的發(fā)生機理奠定理論基礎(chǔ)。

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