Wnt抑制因子SFRP基因甲基化與白血病的關(guān)系

裴 磊，葉麗平

(1中國醫(yī)科大學(xué)，沈陽110001;2遼寧醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室)

近年來研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞行為、基因表達(dá)、腫瘤增生以及細(xì)胞凋亡等生命過程中發(fā)揮重要作用;其異常激活會促進(jìn)細(xì)胞過度生長、增殖和分化，與白血病及其相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系。Wnt通路抑制因子分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP)在結(jié)構(gòu)上與卷曲蛋白(Fz)受體極為相似，與Fz受體競爭結(jié)合Wnt從而抑制Wnt通路的活動。但當(dāng)SFRP異常甲基化導(dǎo)致表達(dá)沉默時，對Wnt通路的抑制作用減弱，從而促進(jìn)了白血病的發(fā)生與發(fā)展。本文就SFRP分子對白血病發(fā)生與發(fā)展的影響進(jìn)行綜述。

1 Wnt基因家族及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與白血病

至今已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Wnt通路的異?；罨c許多腫瘤發(fā)生有著密切關(guān)系。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路因其啟動Wnt蛋白而得名，包括3條細(xì)胞內(nèi)信號通路:① Wnt經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，即Wnt-β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;②Wnt-平面細(xì)胞極性(PCP)途徑;③Wnt-Ca2+途徑［1］。其中 Wnt-β-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是Wnt中最重要也是研究最清楚的信號通路。

Wnt蛋白是一類富含半胱氨酸殘基的分泌型糖蛋白，由Wnt基因編碼，通過自分泌或旁分泌發(fā)揮作用。Wnt蛋白有350～380個氨基酸組成，其中超過100個氨基酸是保守的，包括23～24個半胱氨酸殘基。Wnt蛋白分泌后與細(xì)胞表面基質(zhì)及其特異性受體Fz受體相互作用。Fz受體包括一個細(xì)胞外N端半胱氨酸富集區(qū)(CRD)，7次跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)(CD)。Wnt與Fz受體結(jié)合后，信號經(jīng)由蓬亂蛋白(Dsh)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使由 APC、axin、糖原合成酶激酶(GSK3β)、CK1α 組成的“降解復(fù)合物”聚解［2］，抑制 GSK3β 活性，防止 β-catenin磷酸化，使β-catenin降解受抑，從而使胞內(nèi)游離β-catenin增多。β-catenin可以轉(zhuǎn)位核內(nèi)，與淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子/T細(xì)胞因子(LEF/TCF)族中的轉(zhuǎn)錄活化因子結(jié)合，形成復(fù)合體，解除LEF/TCF的抑制狀態(tài)，增強(qiáng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡［3］。PCP途徑［4］在脊椎動物中又稱Wnt/JUN激酶途徑，涉及到小三磷酸鳥苷酸酶Rac和RhoA，以及它們下游的 Rho激酶和 JUN激酶，主要作用可能是調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移，在胚胎發(fā)育過程中調(diào)控細(xì)胞的匯聚延長運(yùn)動，參與原腸胚的形成［5］。Wnt/Ca2+途徑中，Wnt蛋白與Fz受體結(jié)合，通過三聚體G蛋白介導(dǎo)，使胞內(nèi)Ca2+濃度升高，激活鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、蛋白激酶C(PKC)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動［6］。

在Wnt-/β-catenin途徑中，Wnt信號通過一系列酶促瀑布反應(yīng)，抑制β-catenin的降解，調(diào)控很多基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。一旦Wnt信號通路任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，都會使β-catenin降解受抑，導(dǎo)致在胞內(nèi)積累過多進(jìn)入核內(nèi)，與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，刺激靶基因 c-myc、cyclinD1、MMP-7、ITF-2、fra-1、BMP-4、survivin 等的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)［7，8］，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖、分化，最終導(dǎo)致白血病等腫瘤的發(fā)生。β-catenin核內(nèi)水平增高是經(jīng)典Wnt信號通路誘發(fā)腫瘤的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2 SFRP家族成員及其與Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

SFRP家族是Wnt抑制因子中最大的家族，其中最早發(fā)現(xiàn)的是Frzb，它和Fz有相似的序列，并被發(fā)現(xiàn)在爪蟾蜍體內(nèi)能夠結(jié)合Wnt8，參與調(diào)節(jié)Wnt-β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，成為SFRP作為Wnt拮抗因子的有力證據(jù)。SFRP也是一種分泌性糖蛋白，分子量30～40 kD，包括一個N端與Fz的CRD同源的半胱氨酸富含區(qū)(cysteine-rich domain)和一個C端Netrin-Related motif(NTR)。SFRP在結(jié)構(gòu)上與Fz極為相似，與Fz的胞外CRD區(qū)域有30% ～50%的同源性，但是缺少7次跨膜結(jié)構(gòu)域，可以與Fz競爭結(jié)合Wnt從而抑制Wnt通路的活動。研究者們雖然在開始時的研究中發(fā)現(xiàn)CRD對于SFRP與Wnt結(jié)合起到至關(guān)重要的作用，但是隨后的研究表明CRD可以與 Fz和Tolloid-like金屬蛋白酶相互作用，而NTR與CRD同時存在時也可以緊緊地與Wnt配體結(jié)合［9］。因此可見，SFRP基因的正常表達(dá)對于抑制Wnt信號通路異常激活有著顯著作用，從而控制核內(nèi)β-catenin水平，防止腫瘤誘發(fā)。而Bovolenta等［1］則認(rèn)為，SFRP除了能與Wnt或Fz受體結(jié)合形成復(fù)合體，從而阻斷Wnt信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)外，還可以自身相互作用，形成二聚體，促進(jìn)信號傳導(dǎo);某些SFRP還可以通過轉(zhuǎn)運(yùn)Wnt至Fz受體或直接與Fz結(jié)合，促進(jìn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

3 SFRPs甲基化與白血病

近幾年對 SFRPs的研究發(fā)現(xiàn)，SFRP1、2、4、5啟動子中均含有CpG島結(jié)構(gòu)［10］，且CpG島的頻繁甲基化的表達(dá)下調(diào)作用可以激活Wnt信號通路從而促成腫瘤細(xì)胞抵抗凋亡［11］。一旦SFRP基因高甲基化致轉(zhuǎn)錄沉默，SFRP合成減少，導(dǎo)致Wnt信號通路異常活化，從而使具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性的核心效應(yīng)蛋白β-catenin在細(xì)胞內(nèi)增多并移位核內(nèi)，刺激靶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，最終誘發(fā)相關(guān)腫瘤。如果發(fā)生在白細(xì)胞中，則白細(xì)胞可能會惡性、無限制地增生，浸潤全身各組織和臟器，最終或許會誘發(fā)白血病的發(fā)生。

已有研究表明，Wnt異常信號激活腫瘤的重要機(jī)制是一種或多種可溶性Wnt抑制基因的甲基化，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄沉默所致，且去甲基化后恢復(fù)其表達(dá)可抑制腫瘤的惡性行為，并由此支持SFRP基因?qū)⒊蔀橄嚓P(guān)腫瘤的候選抑癌基因［12］。由于一定程度的SFRP表達(dá)可以抑制Wnt信號通路的傳導(dǎo)，當(dāng)SFRP表達(dá)缺失或基因沉默時都將可能使白細(xì)胞過度增殖，促進(jìn)白血病的進(jìn)展。近年來已有大量研究表明，SFRP基因甲基化普遍存在于各種惡性血液病中。SFRP的CpG島甲基化所導(dǎo)致的基因表達(dá)沉默可引發(fā)慢性淋巴細(xì)胞白血病Wnt信號通路異?；罨?3］。急性白血病中SFRP的高度甲基化也是很常見的現(xiàn)象［14，15］。

3.1 SFRP1 Pehlivan 等［16］為了研究在慢性髓性白血病(CML)中SFRP的表觀遺傳沉默是否與Wnt活化有關(guān)，檢測了48例處在慢性期CML患者的SFRP1啟動子的甲基化和突變水平。結(jié)果顯示有6例患者呈現(xiàn)半甲基化，只有1例患者完全甲基化。盡管在慢性期CML中SFRP1的啟動子甲基化很少發(fā)生，但是FRP1基因啟動子甲基化可能表明了疾病抵抗治療的一種不穩(wěn)定的形式，以及一種可能的CML患者中激活經(jīng)典Wnt信號通路的機(jī)制。Liu等［13］通過細(xì)致研究發(fā)現(xiàn)，在所有的慢性淋巴細(xì)胞白血病患者樣本中，SFRP家族成員之一的SFRP1都呈現(xiàn)高度甲基化狀態(tài)和下調(diào)。這表明這種表觀遺傳學(xué)的事件是白血病的發(fā)生以及發(fā)展中具有關(guān)鍵性的一步。

3.2 SFRP2 Jost等［17］通過分析急性髓性白血病(AML)中SFRP的表觀遺傳調(diào)節(jié)紊亂，利用WSP檢測白血病細(xì)胞系中SFRP1、2、4、5基因啟動子甲基化水平，發(fā)現(xiàn)這四種SFRP基因都出現(xiàn)CpG島上的異常甲基化。實(shí)時反轉(zhuǎn)錄-PCR方法檢測，證明了SFRP1、2轉(zhuǎn)錄沉默，并且對細(xì)胞系中5-aza-2＇-deoxycytidine的治療會導(dǎo)致再表達(dá)，異常甲基化頻率是SFRP1 29%、SFRP2 19%、SFRP4 0%、SFRP5 9%。早期AML患者SFRP2出現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào)并且與啟動子高甲基化之間存在聯(lián)系。Griffiths等［15］發(fā)現(xiàn)，SFRP2基因甲基化與AML病死率密切相關(guān)。

3.3 SFRP4 Liu 等［3］發(fā)現(xiàn) SFRP4 作為 Wnt信號通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，其在CML中基因的甲基化頻率較高。但是在AML中SFRP4基因啟動子甲基化比例不高(10.2%)。Xu等［14］在檢測四種白血病細(xì)胞系SFRP甲基化程度時發(fā)現(xiàn)，SFRP4在NB4、Molt-4和Jurket中發(fā)生甲基化，但是在HL60中甲基化與非甲基化同時被檢測到，呈部分甲基化狀態(tài)。

3.4 SFRP5 Jost等［17］在研究惡性漿細(xì)胞紊亂 Wnt途徑表觀遺傳調(diào)節(jié)失常的臨床影響時，發(fā)現(xiàn)SFRP5的甲基化只局限于成熟期的多發(fā)性骨髓瘤以及漿細(xì)胞白血病，提示SFRP5基因高度甲基化可能對多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生與發(fā)展起到一定作用。Griffiths等［15］研究發(fā)現(xiàn)，SFRP2和SFRP5基因的甲基化程度與AML復(fù)發(fā)的風(fēng)險相關(guān)聯(lián)。

徐成波等［11］通過研究發(fā)現(xiàn)，在9種惡性血液病細(xì)胞系中SFRP1、2基因啟動子區(qū)均呈高甲基化狀態(tài)，CA46、HL60和U937細(xì)胞中的SFRP4基因以及U266細(xì)胞中的SFRP5基因啟動子區(qū)呈部分甲基化狀態(tài)，其他細(xì)胞系SFRP4、5基因啟動子均呈完全甲基化狀態(tài)。正常人外周血單個核細(xì)胞中SFRP1、2、4、5基因啟動子區(qū)均呈非甲基化狀態(tài)。在59例AML患者中，SFRP1、3、4、5基因異常甲基化頻率分別是33.9%、23.7%、6.8%、10.2%;在 28 例急性淋巴細(xì)胞白血病患者中，SFRP1、2、4、5 基因異常甲基化頻率分別為39.3%、28.6%、25.0%、32.1%。這說明 SFRP 基因啟動子區(qū)的異常甲基化與惡性血液病的發(fā)生密切相關(guān)，并且SFRP家族中成員(SFRP1、2、4、5)在各種類型的白血病中甲基化的程度不一，不同的SFRP分子在各種類型白血病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)化的過程中的表達(dá)以及對各種白血病的影響不盡相同。

4 結(jié)語與展望

SFRP家族是Wnt途徑的調(diào)節(jié)因子。SFRP通過抑制Wnt信號通路，在細(xì)胞凋亡、胚胎發(fā)育、抗腫瘤等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，并能抑制細(xì)胞增殖與分化。其表達(dá)缺失、基因沉默或過度表達(dá)都可能促進(jìn)腫瘤發(fā)生，因此與多種惡性腫瘤的產(chǎn)生密切相關(guān)。SFRP基因可能是一個與白血病相關(guān)的抑制基因，抑制Wnt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，在白血病的發(fā)生和發(fā)展過程中起到重要作用，可能成為白血病診斷的一種生物學(xué)標(biāo)記［18］，并且為白血病靶向治療的開展提供新的思路及廣闊的應(yīng)用前景。SFRP對Wnt的調(diào)控活動機(jī)制非常復(fù)雜，尚需進(jìn)一步的研究。

［1］Bovolenta P，Esteve P，Ruiz MZ，et al.Beyond Wnt inhibition:new functions of secreted Frizzled-related proteins in development and disease［J］.JCell Sci，2008，121(Pt6):737-746.

［2］Liu X，Rubin JS，Kimmel AR.Rapid，Wnt2 induced changes in GSK3beta associations that regulate beta-catenin stabilization are mediated by Galpha proteins［J］.Curr Biol，2005，15(2):1989-1997.

［3］Liu F，van den Broek O，Destrée O，et al.Distinct roles for Xenopus Tcf/Lef genes inmediating specific responses toWnt/beta-catenin signalling in mesoderm development［J］.Development，2005，132(24):5375-5385.

［4］Kikuchi A，Yamamoto H，Kishida S.Multiplicity of the interactions ofWnt proteins and their receptors［J］.Cell Signal，2007，19(4):659-671.

［5］Veeman MT，Axelrod JD，Moon RT.A second canon functions and mechanisms ofβ-catenin-independentWnt signaling［J］.Dev Cell，2003，5(3):368-377.

［6］van de Schans VA，Smits JF，Blankesteijn WM.The Wnt/frizzled pathway in cardiovascular development and disease:friend or foe［J］.Eur JPharmacol，2008，585(2-3):338-345.

［7］Wang HL，Wang J，Xiao SY，et al.Elevated protein expression of cyclin D1 and Fra-1 but decreased expression of c-Myc in human colorectal adenocarcinomas overexpressing beta-catenin［J］.Int J Cancer，2002，101(4):301-310.

［8］Cadigan KM，Liu YI.Wnt signaling:complexity at the surface［J］.JCell Sci，2006，119(Pt3):395-402.

［9］Esteve P，Bovolenta P.The advantages and disadvantages of sfrp1 and sfrp2 expression in pathological events［J］.Yohoku JExp Med，2010，221(1):11-17.

［10］Esteller M，Com PC，Baylin SB，et al.A gene hypermethylation profile of human cancer［J］.Cancer Res，2001，61(8):3225-3229.

［11］徐成波，沈建箴.惡性血液病細(xì)胞系分泌型卷曲相關(guān)蛋白基因啟動子CpG島甲基化狀態(tài)的檢測及意義［J］.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2009，17(6):1487-1491.

［12］羅麗敏，王俐.Wnt通路抑制因子Sfrp的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2007，13(10)，729-731.

［13］Liu TH，Raval A.CpG islandmethylation and expression of the secreted frizzled-related protein gene family in chronic lymphocytic leukemia［J］.Cancer Res，2006，66(2):653-658.

［14］Xu CB，Shen JZ，Shen SF，et al.The significance ofmethylation status of secreted frizzled-related protein gene promoter in acute leukemia［J］.Zhonghua Neine Zazhi，2010，49(9):769-771.

［15］Griffiths EA，Gore SD.Acutemyeloid leukemia is characterized by Wnt pathway inhibitor promoter hypermethylation［J］.Leuk Lymphoma，2010，51(9):1711-1719.

［16］Pehlivan M，Sercan Z.sFRP1 promoter methylation is associated with persistent Philadelphia chromosome in chronicmyeloid leukemia［J］.Leuk Res，2009，33(8):1062-1067.

［17］Jost E，Schmid J.Epigenetic inactivation of secreted Frizzled-related proteins in acutemyeloid leukaemia［J］.Br JHaematol，2008，142(5):745-753.

［18］Ahn JB，ChungWB.DNAmethylation predicts recurrence from resected stage IIIproximal colon cancer［J］.Cancer，2011，117(9):1847-1854.