實(shí)時定量RT-PCR檢測PML-RARα融合基因診斷APL的臨床價值

陸 偉，秦 燕，丁潤生，尹 紅

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001)

急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)是急性髓系白血病(AML)的一個特殊類型，95%以上APL存在 t(15;17)(q22;q21)染色體易位，產(chǎn)生PML-RARα融合基因，是APL診斷和微小殘留病(MRD)的重要分子標(biāo)志［1］。根據(jù) PML基因的斷裂位點(diǎn)不同，PML-RARα融合基因可分為3種，分別為L型、V型S型，在PML-RARα融合基因中所占比例分別為50%、5%、45%［2］。我們應(yīng)用一步法實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RQ-RT-PCR)針對上述最特異、最常見的惡性克隆基因片段，檢測APL患者初診及緩解后融合基因轉(zhuǎn)錄本mRNA的表達(dá)，探討其在APL患者診斷及MRD檢測中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2008年6月～2011年4月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科就診的初發(fā)APL患者42例，男27例、女15例，年齡18～64歲、中位年齡36歲;均根據(jù)形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)和遺傳學(xué)檢查確診。選擇其中經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)治療(全反式維甲酸和三氧化二砷的聯(lián)合化療)獲得完全緩解(CR)、有完整臨床和實(shí)驗(yàn)室資料的30例患者進(jìn)行MRD檢測，自獲得CR起2年內(nèi)每3個月、2年后每6個月收集標(biāo)本1次，共112份(42份治療前APL骨髓標(biāo)本，70份APL-CR骨髓標(biāo)本)骨髓標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理及核酸制備 抽取患者骨髓液EDTA 抗凝，取 100 μl加入 300 μl Trizol，-80 ℃以下保存?zhèn)溆??？俁NA采用Trizol-氯仿—異丙醇—乙醇提取，將抽提好的RNA加至60 μl RNAase-free水混勻溶解，立即進(jìn)行檢測或-80℃以下保存?zhèn)溆?。主要試劑和儀器為白血病融合基因檢測試劑盒(上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司)、ABI Prism熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(美國)、FACSCalibur流式細(xì)胞儀及主要單克隆抗體HLA-DR-FITC、CD117-PE、CD123-Percpcy5.5、CD34APC(美國 BD 公司)。

1.2.2 RQ-RT-PCR方法 每份標(biāo)本利用 Taqman探針在ABI Prism熒光定量PCR檢測系統(tǒng)上同時檢測PML-RARα和ABL基因的表達(dá)。以內(nèi)參基因ABL檢測 PML-RARα擴(kuò)增的模板質(zhì)量，用 PMLRARα融合基因兩對引物分別擴(kuò)增L型和S型2個不同的轉(zhuǎn)錄本。反應(yīng)體系為25 μl(反應(yīng)液8 μl加混合酶液2 μl和15 μl已抽提的 RNA)，擴(kuò)增條件:42 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min;94 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)。在PCR循環(huán)第2步60℃時收集熒光信號，檢測通道為:FAM-TAMRA，參比熒光定為none。每組均設(shè)置陰性對照和陽性對照，最低檢出限為1×102copies。每批標(biāo)本均以陽性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒ABL 1×103～1×106個數(shù)量級范圍作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果均以標(biāo)準(zhǔn)拷貝數(shù)(NCN)表示，即將同一份標(biāo)本PMLRARα拷貝數(shù)/ABL拷貝數(shù)來計(jì)算PML-RARα轉(zhuǎn)錄本的相對表達(dá)量，單位為%。采用7500軟件V2.0.1版本分析結(jié)果。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測 APL-CR患者的MRD 選擇30份APL初診時免疫表型符合HLADR-/CD117+/CD123+/CD34-的CR患者骨髓在進(jìn)行RQ-RT-PCR檢測的同時進(jìn)行FCM檢測MRD。四色直標(biāo)，分析5×105個細(xì)胞，篩查 HLA-DR-/CD117+/CD123+/CD34-的細(xì)胞群。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APL患者的 RQ-RT-PCR結(jié)果 42例初診APL患者的 PML-RARα融合基因轉(zhuǎn)錄本的中位NCN為61%(13% ～284%)，其中L型34例，S型8例。L型和S型異構(gòu)體中位NCN分別為56%(28%～278%)和70%(13% ～284%)，L型和 S型轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.2 RQ-RT-PCR檢測APL-CR患者 MRD 70份APL-CR骨髓標(biāo)本PML-RARα融合基因轉(zhuǎn)錄本中位NCN 為4.00%(0.00% ～8.26%)。其中有 26 份NCN≥0.01%，考慮有分子生物學(xué)復(fù)發(fā)風(fēng)險。參照試劑盒說明書結(jié)果判斷:NCN≥0.01%為MRD陽性，NCN＜0.01%為MRD陰性。

2.3 FCM檢測APL-CR患者M(jìn)RD FCM對符合要求的30份APL-CR骨髓進(jìn)行MRD檢測，其中有11例 CD34-/CD117+/CD123+/HLA-DR-細(xì)胞≥0.09%。MRD判斷標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)實(shí)驗(yàn)室正常骨髓中此類細(xì)胞的比例在0.050% ～0.086%，確定 MRD≥0.09%為陽性，MRD ＜0.09%為陰性。

2.4 RQ-RT-PCR和FCM同時檢測結(jié)果比較 30份骨髓標(biāo)本，RQ-RT-PCR法檢測MRD陽性14例，陰性16例;FCM法檢測MRD陽性11例，陰性19例。兩種方法均陽性10例，均陰性15例，符合率83.3%(25/30)。顯示兩種方法有較好的一致性(χ2=0.278，P=0.598)。

3 討論

95%的APL患者有t(15;17)(q22;q21)染色體易位，形成PML-RARα融合基因，此為APL特異性細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志。但APL除了典型的t(15;17)外，少量患者存在t(11;17)和t(5;17)等其他涉及17號染色體的易位，這類患者對維甲酸治療反應(yīng)差，故早期正確檢測PML-RARα融合基因，對明確診斷、指導(dǎo)治療、提示預(yù)后具有重要的意義。

我們采用一步法RQ-RT-PCR，巧妙地將RT反應(yīng)和隨后的PCR反應(yīng)融入一個體系中，大大減少了非特異性cDNA鏈的合成。整個反應(yīng)完全在一個反應(yīng)管中進(jìn)行，一次加樣后即可完成全部反應(yīng)，最大限度減少實(shí)驗(yàn)操作，而且避免在加樣過程中對反應(yīng)產(chǎn)物造成污染。同時采用Taqman探針熒光定量技術(shù)，比定性PCR技術(shù)具有更好的特異性和靈敏度。融合基因轉(zhuǎn)錄本拷貝數(shù)以ABL內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，從而校正了由于加樣、探針熒光衰退等造成的誤差，使結(jié)果更直觀、可靠。本實(shí)驗(yàn)對42例初治APL患者檢測了PML-RARα融合基因的L型和S型兩種常見異構(gòu)體類型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為L型34例，S型8例，轉(zhuǎn)錄本的中位NCN為61%(13% ～284%)。NCN值可直觀地用來比較患者治療前后的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平變化。

隨著治療方案的改進(jìn)，APL患者的生存期大大延長，但CR患者仍存在復(fù)發(fā)的危險，MRD的存在是導(dǎo)致復(fù)發(fā)的主要原因。曾有研究結(jié)果顯示，MRD在0.5×10-5～5×10-5時與隨后的復(fù)發(fā)無相關(guān)性［3］，即當(dāng) MRD＜10-5時已不能提示臨床復(fù)發(fā)。RQ-RT-PCR技術(shù)敏感度達(dá)到10-6～10-4，可有效檢測體內(nèi)的殘留白血病細(xì)胞［4］。本文通過對30例APL-CR患者的動態(tài)檢測，70份骨髓標(biāo)本的PMLRARα融合基因中位 NCN為 4.00%(0.00% ～8.26%)，明顯低于初診時。有26份PML-RARα融合基因 NCN≥0.01%，考慮有分子生物學(xué)復(fù)發(fā)風(fēng)險。Jurcic等［5］認(rèn)為PCR檢測MRD 2次以上陰性的患者，僅7%發(fā)生復(fù)發(fā)，而2次以上陽性者則100%復(fù)發(fā)。因而，CR患者定期行RQ-RT-PCR檢測有助于早期發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展，便于在血液學(xué)復(fù)發(fā)前進(jìn)行挽救性治療。

文獻(xiàn)報道［6］與本室結(jié)果證實(shí)，APL具有較特異的免疫表型:SSC較大，CD34、HLA-DR都為陰性，CD117表達(dá)率達(dá)80%左右。CD123是APL干細(xì)胞的一個獨(dú)特的標(biāo)志，正常造血干細(xì)胞極少表達(dá)，因此，利用 CD34-/CD117+/CD123+/HLA-DR-抗體組合可有效地對符合該表型的APL-CR患者進(jìn)行MRD檢測。選擇其中30份初診時符合該免疫表型的骨髓標(biāo)本利用FCM檢測MRD，發(fā)現(xiàn)兩者有較好的一致性。本組有4例臨床緩解標(biāo)本FCM檢測結(jié)果為陰性，而RQ-RT-PCR檢測到PML-RARα融合基因轉(zhuǎn)錄本，可能與RT-PCR敏感性高于FCM有關(guān)。1例FCM檢測到MRD而RQ-RT-PCR結(jié)果為陰性，與其存在一定的假陰性有關(guān)。

綜上所述，以Taqman探針熒光定量技術(shù)，用ABL為內(nèi)參基因的一步法RQ-RT-PCR不僅操作簡便、檢測快速，而且結(jié)果直觀、可靠，具有很好的靈敏度和特異性，在APL診斷和MRD的檢測中具有重要的臨床價值。

［1］Melo RA，de Vasconcellos JF，Melo FC，et al.PML-RARalpha fusion gene transcripts and biological features in acute promyelocytic leukemia patients［J］.Clin Lab Haematol，2006，28(2):126-129.

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［3］Roberts WM，Estrov Z，Ouspenskaia MV，et al.Measurement of residual leukemia during remission in childhood acute lymphoblastic leukemia［J］.N Engl Med，1997，336(5):317-323.

［4］Gallagher RE，Yeap BY，Bi W，et al.Quantitative real-time RTPCR analysis of PML-RAR alpha mRNA in acute promyelocytic leukemia:assessment of prognostic significance in adult patients from intergroup protocol 0129［J］.Blood，2003，101(7):2521-2528.

［5］Jurcic JG，Nimer SD，Scheinberg DA，et al.Prognostic significance of minimal residual disease detection and PML/RARα isoform type:long-term follow-up in acute promyelocyetic leukemia［J］.Blood，2001，98(9):2651-2656.

［6］沈紅強(qiáng)，湯永民，宋華，等.CD117/CD11b在急性早幼粒細(xì)胞白血病不同病期的表達(dá)變化［J］.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2006，14(4):644-648.