近紅外光譜技術(shù)對膠質(zhì)瘤大鼠優(yōu)化散射系數(shù)的研究

郭 凱，楊天明*，錢志余，張立國，劉華亭

(1東南大學附屬中大醫(yī)院，南京210009;2南京航空航天大學)

膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)外胚層，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤(約占30%)。目前膠質(zhì)瘤的無創(chuàng)定位方法主要是MRT、CT、PET，然而膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長并與腦組織無明顯分界，傳統(tǒng)的檢測方法所檢測到的腫瘤邊界隨著術(shù)中腦位置變化和腦脊液改變而變化，因此，為盡可能切除腫瘤細胞需要開發(fā)一種新的檢測方法來更好地定位腫瘤范圍［1，2］。近紅外光譜技術(shù)將空間分辨率提高到單細胞分子水平，以無創(chuàng)或微侵襲、準確度高的特點逐漸應用于臨床腫瘤的診斷。本實驗于2010年3～11月利用近紅外光譜采集系統(tǒng)實時在位采集C6膠質(zhì)瘤大鼠的優(yōu)化散射系數(shù)，通過對其分析來判斷腦組織類型，為膠質(zhì)瘤研究提供一種新的實時診斷技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與材料 江灣I型C動物立體定向儀，微創(chuàng)近紅外組織參數(shù)測試系統(tǒng)，特制的Y型雙光纖微探頭，鹵素光源，光譜儀，自動步進系統(tǒng)，MID－7604步進電機驅(qū)動器，PCR－7344控制器，計算機及相關(guān)軟件。

1.2 細胞與動物 大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞(購自中國科學院上海細胞庫)，培養(yǎng)于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基為加入15%馬血清及2.5%胎牛血清的F－12K培養(yǎng)液。在細胞對數(shù)生長期大約滿85%時，以0.25%胰酶消化，收集消化液，離心后去除上清液，F(xiàn)－12k液洗2次后制成細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞濃度至1×107～1 ×108/10 μl，置于 33 ℃恒溫搖床待接種。苔盼藍排斥實驗檢測細胞活力＞95%。選取健康成年Sprague Dawley(SD)大鼠(購自南京青龍山實驗動物養(yǎng)殖中心)40只，體質(zhì)量250 g，雌雄不限，隨即選取20只建模，另外20只作為正常對照組。

1.3 實驗方法

1.3.1 膠質(zhì)瘤大鼠模型的建立及鑒定 大鼠術(shù)前12 h禁食禁水，麻醉前30 min肌肉注射阿托品0.05 mg以抑制呼吸道分泌，并在實驗過程中每小時肌肉注射阿托品0.05 mg維持。腹腔注射1%戊巴比妥進行麻醉，體溫控制在37.5℃。麻醉后將大鼠固定于江灣Ⅰ型立體定向儀上，暴露前囟，以前囟為原點，向后1 mm、中線向右旁開3.0 mm，用牙科磨鉆打一直徑1 mm小孔。微量進樣針將10 μl細胞懸液緩慢注入硬腦膜下5 mm處的腦組織中，停針5 min后退針，骨蠟封閉骨孔，清洗切口后縫合。常規(guī)飼養(yǎng)14 d后將大鼠用常規(guī)劑量戊巴比妥鈉麻醉，用7.0 T德國bruker公司生產(chǎn)實驗小動物專用磁共振儀行平掃。

1.3.2 膠質(zhì)瘤大鼠的優(yōu)化散射系數(shù)測定 將膠質(zhì)瘤組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，固定于立體定向儀框架，將三維坐標調(diào)零。常規(guī)消毒后切開頭皮約1.0 cm，剝離骨膜，用牙科磨鉆在原建模時的骨孔處打一直徑3 mm的小孔，利用生物組織近紅外光譜自動測試系統(tǒng)，在骨孔處進行近紅外光學參數(shù)測量。微創(chuàng)光纖探頭以硬腦膜為測試零點，并在立體定向儀的定位和步進電機控制下開始活體在位測量相關(guān)參數(shù)(測量步長0.1 mm，測量深度約6 mm)。測量結(jié)束后緩慢退出近紅外探頭，鉆孔使用骨蠟覆蓋，常規(guī)縫合傷口，整個過程在超凈工作臺內(nèi)進行，術(shù)后無需抗生素防治感染，術(shù)后對大鼠行MRI掃描。掃描后麻醉處死大鼠，取腦固定于10%福爾馬林溶液24 h以上，石蠟包埋，切片，HE常規(guī)染色。正常對照組大鼠的優(yōu)化散射系數(shù)測定步驟同上。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，組內(nèi)行單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MRI結(jié)果 正常對照組大鼠腦組織可以清晰看出微創(chuàng)光纖探頭從硬腦膜開始經(jīng)皮層、白質(zhì)然后到達基底節(jié)區(qū)。膠質(zhì)瘤腦組織可看到膠質(zhì)瘤呈橢圓形侵犯整個右側(cè)基底節(jié)區(qū)域及白質(zhì)部分，并越過中線擠壓左側(cè)基底節(jié)區(qū)域的腦組織而且伴有腦水腫。

2.2 HE染色結(jié)果 膠質(zhì)瘤大鼠處死后取腦切片行HE染色，左側(cè)藍染區(qū)域可見C6膠質(zhì)瘤細胞聚集，右側(cè)淡染區(qū)域為正常組織并明顯可見C6膠質(zhì)瘤細胞浸潤。

2.3 優(yōu)化散射系數(shù)測量結(jié)果 膠質(zhì)瘤大鼠的優(yōu)化散射系數(shù)一維曲線較為平直、穩(wěn)定。在波長690 nm處對照組和C6膠質(zhì)瘤組優(yōu)化散射系數(shù)分別為(19.86±0.86)、(17.69±1.70)cm－1(P ＜0.05)。

3 討論

近紅外光譜技術(shù)是近幾年發(fā)展的一種檢測組織結(jié)構(gòu)性質(zhì)和動態(tài)功能的新技術(shù)。目前應用于多種病理生理狀況下腦組織的監(jiān)測，但是大多是用于監(jiān)測腦組織血流動力學改變或腦氧代謝，用于腦組織類型的精確識別及病理情況下檢測的研究較少。楊天明等利用近紅外光譜技術(shù)通過探頭穿刺過程中的近紅外光反射系數(shù)R推算腦組織光學參數(shù)，證實了腦灰質(zhì)與腦白質(zhì)間光學特性有差異。相對于正常腦組織，腦膠質(zhì)瘤含有較低的脂質(zhì)及大量的髓鞘增生［1］。腫瘤的生物學行為受諸多因素影響，如瘤體的血管生成和能量代謝等。瘤體的形成過程中，血管生成因子過度表達，血管生成迅速，部分管壁不完整甚至出血壞死［3］。而腫瘤的能量代謝分為有氧代謝和無氧代謝，Ⅱ～Ⅲ級C6膠質(zhì)瘤多為有氧代謝，能量代謝率較高［4］。因此，當腦組織結(jié)構(gòu)及組成成分發(fā)生變化時對光的散射特性也會出現(xiàn)變化，優(yōu)化散射系數(shù)可反應出這種變化。優(yōu)化散射系數(shù)既是組織結(jié)構(gòu)的固有光學特征，又能反映與神經(jīng)元活動相關(guān)的變化，且受組織內(nèi)血流量、血紅蛋白及水含量等影響小，與吸收系數(shù)相比數(shù)值相對穩(wěn)定，宜作為組織定位時的特征參數(shù)。在高散射介質(zhì)的生物組織中(如腦組織)優(yōu)化散射系數(shù)遠大于吸收系數(shù)，故優(yōu)化散射系數(shù)更穩(wěn)定，對變化更敏感。

本實驗我們用特制的內(nèi)置雙光纖微針管樣探頭［5，6］微創(chuàng)實時在位監(jiān)測C6荷瘤鼠腦基底節(jié)區(qū)腫瘤的優(yōu)化散射系數(shù)，并與對照組比較，結(jié)果表明C6荷瘤鼠基底節(jié)區(qū)腫瘤的優(yōu)化散射系數(shù)明顯低于對照組。由此證實近紅外光譜技術(shù)對膠質(zhì)瘤的診斷具有安全可靠、連續(xù)實時、便捷、低成本、無創(chuàng)、操作時程短和對人體生理狀態(tài)影響小等優(yōu)點，具有較高的應用價值。

［1］Amharref N，Beljebbar A，Dukic S，et al.Brain tissue characterisation by infrared imaging in a rat glioma model［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1758(7):892－899.

［2］Krafft C，Sobottka SB，Schackert G，et al.Near infrared Raman spectroscopic mapping of native brain tissue and intracranial tumors［J］.Analyst，2005，130(7):1070－1077.

［3］ Tuettenberg J，F(xiàn)riedel C，Vajkoczy P.Angiogenesis in malignant glioma－－a target for antitumor therapy［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2006，59(3):181－193.

［4］Pasdois P，Deveaud C，Voisin P，et al.Contribution of the phosphorylable complex I in the growth phase－dependent respiration of C6 glioma cells in vitro［J］.J Bioenerg Biomembr，2003，35(5):439－450.

［5］錢志余，陳仁文，顧月清，等.生物組織光學參數(shù):優(yōu)化散射系數(shù)(μ’s)的實時在位測定［J］.南京航空航天大學學報，2004，36(3):369－372.

［6］錢志余，顧月清，劉漢莉，等.實時在位測定大鼠腦組織優(yōu)化散射系數(shù)(μ’s)的技術(shù)研究［J］.中國醫(yī)學物理學雜志，2005，22(2):463－465.