食品中阿維菌素類藥物殘留檢測方法研究進展

廉慧鋒，宋 潔，張文娟，宋 歡

（1.山西出入境檢驗檢疫局，山西太原030024；2.山西大學生命科學學院，山西太原030006）

阿維菌素類藥物（Avermectins，AVMs）是由鏈霉素（streptomyces avermitilis）產(chǎn)生的一組類似于大環(huán)內(nèi)酯類藥物的物質(zhì)，由于有殺蟲活性強[1-2]、殺蟲譜廣的特點，成為現(xiàn)代農(nóng)牧業(yè)上用量最大的抗寄生蟲藥物[3]。目前，已商品化的主要品種有阿維菌素（Avermectin，AVM）、伊維菌素（Ivermectin，IVM）、多拉菌素（Dommectin，DOR）、埃普菌素（Eprinomectin，EP）、莫西丁克（Moxidectin，MOX）和塞拉菌素（Selamectin，SEM）。

AVMs屬于微生物源農(nóng)藥，對大鼠的LD50為10 mg/kg，與對硫磷的LD50（3.5～12.5 mg/kg）相仿[4]。AVMs作為脂溶性藥物，在動物體內(nèi)殘留時間長，對哺乳動物的生殖能力存在著潛在的毒性[5]。按世界衛(wèi)生組織5級分類標準，將其列為高毒農(nóng)藥[6]。隨著我國社會經(jīng)濟和生活水平的提高，食品安全問題引起了全社會的廣泛重視。幾乎每個國家都有食品中AVMs殘留限量的規(guī)定，美國、歐盟、日本和中國等均制定了AVMs的最高殘留限量（MRL）。中國農(nóng)業(yè)部規(guī)定其在柑橘、梨和黃瓜中的MRL值為20 μg/kg，葉菜和豇豆中的MRL值為50 μg/kg；歐盟規(guī)定在果蔬、谷物等農(nóng)產(chǎn)品中MRL值為10 μg/kg；韓國規(guī)定其在蘋果中的MRL值為20 μg/kg，芹菜為50 μg/kg；以色列規(guī)定其在黃瓜、茄子、桃子、草莓等果蔬產(chǎn)品中的MRL值為10 μg/kg；澳大利亞規(guī)定在蘋果、梨、番茄等產(chǎn)品中的MRL值為10 μg/kg；國際食品法典委員會規(guī)定在蘋果、梨、柑橘、瓜類等產(chǎn)品中的MRL值為10 μg/kg[7]。筆者就近年來有關阿維菌素的分析方法研究作一簡要綜述。

1 前處理方法

阿維菌素類藥物的凈化方法包括液液萃取、固相柱萃取（SPE）、固相基質(zhì)分散（MSPD）以及超臨界流體萃取等方法。其中，SPE凈化方法為常用的凈化方法，學者們采用不同類型的SPE柱，都取得了較好的效果。

1.1 液液萃取法

梁振益等[8]在測定蔬菜與水果中阿維菌素殘留量時，用液液萃取法凈化了蔬菜（青瓜、菠菜）與水果（梨）的樣品提取液。張侃侃等[9]測定甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽在水稻植株、稻米、稻田水樣及土壤中的消解動態(tài)和最終殘留時，用液液萃取法凈化了由丙酮-水、二氯甲烷提取的水稻、稻米和土壤的樣品液。

1.2 固相基質(zhì)分散法（MSPD）

Barker等[10]對固相基質(zhì)分散法（MSPD）在分析化學上分離和提取固體、半固態(tài)或高黏性生物樣品的應用進行了詳細的介紹。張倩等[11]對MSPD各參數(shù)進行了優(yōu)化和設計，建立了4種蔬菜中阿維菌素的MSPD前處理法。

1.3 超臨界流體萃取法（SFE-HPLC-RLD）

Danaher等[12]建立了動物肝臟中阿維菌素、伊維菌素、依立菌素和多拉菌素的多殘留超臨界流體凈化方法。李珠柱等[13]采用超臨界流體技術能有效地把模型藥物阿維菌素吸附到多孔空心結(jié)構中，吸附量可達61.5%。

1.4 固相柱萃取法（SPE）

繆琪等[14]建立了固相柱萃取-高效液相色譜法（SPE-HPLC），檢測枸杞中阿維菌素B1a殘留量的方法，樣品用乙腈提取，經(jīng)C18固相萃取柱凈化，采用C18柱分離。張云等[15]在對鰻魚的測定中用堿性氧化鋁柱對樣品提取液進行凈化去脂。

2 檢測技術

AVMs在食品中的殘留量極微[16]，須選擇特異性強、靈敏度高、速度快的檢測方法。儀器分析技術的準確性、精密性與免疫分析技術的簡便快捷相結(jié)合，該聯(lián)合技術應用日趨廣泛，同時多殘留分析技術也是AVMs殘留分析技術的發(fā)展方向。AVMs分子質(zhì)量大，極難氣化，目前尚無可行的氣相色譜衍生化方法，無法采用氣相色譜分析。

阿維菌素類藥物殘留檢測方法中酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）靈敏度較高，操作簡單快速，但重復性不好，且不易標準化。高效液相色譜-紫外檢測器（HPLC-UV）前處理較簡單，具有較好的準確度和精密度，但由于其檢測限較高，一般多用于阿維菌素類藥物制劑的檢測。高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FLD）的檢測限低，干擾少，是目前使用最廣泛的阿維菌素類藥物殘留的檢測方法[17]。但液相色譜-熒光檢測法需要繁瑣的衍生化反應，前處理較為復雜，檢測的特異性和靈敏性也不強，耗時較長。因此，具有高選擇性、高靈敏性、前處理簡單易行的高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法（HPLC-MS）和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS-MS）將逐步成為阿維菌素類藥物殘留分析的主流方法[18]。

2.1 高效液相色譜法（HPLC）

HPLC是以液體為流動相的一種色分離技術，采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測及高效微粒固定相（粒度5～10 μm)，從而在分離速度、分離效能、靈敏度、定性定量、可靠性等方面都達到和氣相色譜法相媲美的程度，保持了液相色譜對樣品適用范圍廣、流動相可選擇的種類多等特點。

AVMs的共軛二烯結(jié)構在λ=240～250 nm處有強烈的紫外吸收，利用此特點，可建立紫外檢測，但在此光譜區(qū)域存在著皮質(zhì)激素、維生素、脂類、酸等眾多內(nèi)源性物質(zhì)，嚴重地干擾了AVMs的色譜分析[19]，因此，紫外測定法并不適合AVMs的殘留分析。但熒光衍生化方法檢測卻可彌補紫外測定方法的不足。熒光檢測法使檢測的選擇性和靈敏度顯著提高，檢測限較紫外法低約1～2個數(shù)量級，可滿足AVMs殘留分析需要，但該方法對樣品凈化要求比較嚴格。

目前，關于熒光檢測方法[20]的報道比較多。侯曉林等[21]采用高效液相色譜分離，熒光檢測器檢測，建立了固相萃取分析牛組織中埃普利諾菌素、阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素殘留的方法，樣品用乙腈提取，堿性氧化鋁和C18-SPE柱凈化，用乙酸酐和1-甲基咪唑的乙腈溶液作衍生化試劑，96℃條件下，完全衍生化需要100 min，衍生化反應繁瑣，前處理較為復雜。Berendsen等[5]也從有機化學的角度用HPLC-FLD法針對牛奶中的阿維菌素類藥物的多殘留進行了新的定性和定量分析。

2.2 酶聯(lián)免疫法（ELISA）

HPLC方法雖然取得了很好的試驗結(jié)果，卻需復雜的前處理過程和昂貴的儀器。因而，各國學者紛紛致力于檢測技術的推陳出新，其中免疫技術的發(fā)展，為此提供了新的契機。免疫分析法是將免疫反應與現(xiàn)代測試手段相結(jié)合而建立的超微量測定方法。免疫分析法有熒光免疫測定法、酶免疫測試法、放射免疫測定法[22]。

ELISA主要以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應為基礎，依靠比色來確定農(nóng)藥殘留情況的檢測方法。酶聯(lián)免疫測定技術是生物酶技術與免疫分析技術相結(jié)合應用于農(nóng)藥殘留分析領域的一門新技術，目前已有部分特異性的酶聯(lián)免疫試劑盒投入使用[23]。ELISA和免疫學方法與儀器分析方法不同，它可使分析過程簡化，適合復雜基質(zhì)中痕量組分的分析、大批量樣品的篩選。由于AVMs藥物是半抗原，不能刺激機體產(chǎn)生抗體，需與大分子載體物質(zhì)（如蛋白質(zhì)）相結(jié)合制備人工抗原，免疫動物產(chǎn)生特異性抗體，然后建立免疫競爭法。趙衛(wèi)東等[24]用酶聯(lián)免疫法（ELISA），建立定量檢測動物源性產(chǎn)品中阿維菌素殘留的方法。免疫分析檢測具有一定的盲目性，以及抗體依賴于國外進口等因素的影響，使酶聯(lián)免疫法的應用范圍受到較大的限制[23]。

2.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）

試驗證明，液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）分析大環(huán)內(nèi)酯類抗生素具有快速、高靈敏度的優(yōu)點，對沒有紫外吸收特征的抗生素以及對有交叉組分的抗生素具有良好的完全分離和定性分析的能力。所以，LC-MS是AVMs的理想確證方法，一般檢測限可達到2～5 ng/g，在5～100 μg/kg之間回收率可達70%～94%[25]。

Dureden[26]在電噴霧電離（ESI）模式下，比較了幾種阿維菌素類藥物產(chǎn)生正負離子的行為特征，建立了牛奶中阿維菌素類藥物多殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，其檢測低限僅為0.5 μm/L。Hemandom等[27]采用液相色譜線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜技術，測定了鮭魚肉等食品中阿維菌素類藥物殘留，定量下限0.1～5 μg/kg。Sherdan等[28]研究報道了牛奶中5種AVMs驅(qū)蟲劑，即伊維菌素、阿維菌素、依立菌素、莫西菌素和米爾倍霉素的多殘留檢測方法。此方法使用簡單的液液萃取，后用液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術（LC-MS-MS）進行定性、定量分離檢測。

此外，近幾年來在我國采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對阿維菌素類藥物的研究和檢測也有了長足的進展。楊方等[29]建立了采用超高效液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測茶葉中愛比菌素、甲胺基阿維菌素、乙酰胺基阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和莫西丁克6種藥物殘留的檢測方法。董靜等[30]建立了動物源性食品中阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、莫西菌素、埃普菌素、乙酰胺基阿維菌素6種阿維菌素類藥物殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。該方法穩(wěn)定、可靠，可滿足動物源性食品中阿維菌素類藥物殘留檢測與確證的需要。高華鵬等[31]建立了同時快速測定鰻魚中AVM，DOR，IVR的超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法。趙東豪等[32]建立了以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測豬肉中阿維菌素、多拉菌素及伊維菌素3種大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留的分析方法。

3 發(fā)展趨勢

綜觀AVMs的檢測技術，其發(fā)展趨勢是向確證方法和多殘留分析方向發(fā)展，研究主要集中在3個方面，即快速篩選方法的建立、樣品前處理方法的改進和對陽性樣品進行確證。液質(zhì)聯(lián)用殘留檢測技術除具有高度的選擇性和靈敏度，并且對凈化要求低，可以同時進行定性確證和定量檢測，方法簡便、操作性強，且有良好的準確性和精密性，使得分析過程簡化，適合復雜樣品中的痕量分析。正由于液質(zhì)聯(lián)用技術集色譜的高分離能力、質(zhì)譜的高靈敏度和高選擇性于一體，已逐漸成為當代最重要的分離和鑒定分析方法之一。

［1］賈變桃，劉鵬琰，賈虎，等.10種殺蟲劑對小菜蛾室內(nèi)生物活性比較[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2011，39（1）：67-68.

［2］謝燕楠，陸凱文，鐘方紅，等.阿維菌素對稻飛虱防效及對天敵的影響[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2009（2）：58.

［3］Tsukamoto Y，Cole L M，Casida J E.Avermectin chemistry and action:ester-and ether-type candidate photoaffinity probes[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry，2000，8（1）：19-26.

［4］Sanderson H，Laird B，Pope L，et al.Assessment of the environmental fate and effects of ivermectin in aquatic mesocosms[J].Aquatic Toxicology，2007，85（4）：229-240.

［5］Berendsen BJ A，Mulder P P J，van Rhijn H J A.The derivatisation of avermectins and milbemycins in milk:New insights and improvement of the procedure[J].Analytica Chimica Acta，2007，585（1）：126-133.

［6］王學臣，袁廷城，韓福友，等.10.5%阿維菌素·毒死蜱乳油防治蘋果樹桃小食心蟲田間藥效試驗 [J].天津農(nóng)業(yè)科學，2009，15（Z1）：2.

［7］孫明娜，王梅，段勁生，等.阿維菌素殘留檢測技術研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2006，34（12）：2778-2779，2842.

［8］梁振益，李嘉誠，羅盛旭，等.高效液相色譜法測定蔬菜與水果中阿維菌素殘留量[J].現(xiàn)代農(nóng)藥，2005，4（4）：20-22.

［9］張侃侃，胡德禹，張鈺萍，等.甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽在水稻環(huán)境中的殘留及消解動態(tài) [J].農(nóng)藥學學報，2010，12（2）：190-194.

［10］Barker S A.Matrixsolid phase dispersion（MSPD）[J].Journal of Biochemical and Biophysical MethodsSample Preparation，2007，70（2）：151-162.

［11］張倩，杜海云，馮磊，等.MSPD-HPLC/MS（ESI）法測定蔬菜中的阿維菌素[J].中國農(nóng)學通報，2009，25（20）：110-114.

［12］ Danaher M，Howells L C，Crooks S R H，et al.Review of methodology for the determination of macrocyclic lactone residues in biological matrices[J].Journal ofChromatography：B，2006，844（2）：175-203.

［13］李珠柱，文利雄，黎穎，等.正交實驗法優(yōu)化空心多孔SiO2納米球?qū)Π⒕S菌素的吸附條件 [J].過程工程學報，2006，6（1）：82-86.

［14］繆琪，孔祥虹，韓舜愈，等.SPE-HPLC法測定枸杞中阿維菌素 B1a殘留量[J].分析試驗室，2007，26（7）：97-99.

［15］張云，江昌木，陳虹，等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定鰻魚中阿維菌素和伊維菌素殘留量[J].分析試驗室，2008，27（Z1）：104-107.

［16］ Mascari T M，F(xiàn)oil L D.Oral treatment of rodents with ivermectin for the control of Phlebotomus papatasi（Diptera:Psychodidae）under laboratoryconditions[J].Veterinary Parasitology，2010，171（1/2）：130-135.

［17］XUQ，XIANGW.Developmentand validation ofan HPLC-FLD method for milbemectin quantification in dog plasma[J].Journal ofChromatography：B，2010，878（22）：2013-2017.

［18］Benincasa C，Perri E，Iannotta N，et al.LC/ESI-MS/MS method for the identification and quantification of spinosad residues in olive oils[J].Food Chemistry，2011，125（3）：1116-1120.

［19］Pollmeier M，Maier S，Moriarty K，et al.High-performance liquid chromatographic assay for the determination of a semisynthetic avermectin analog（eprinomectin）in bovine milk at parts per billion levels—method development and validation[J].Journal of Chromatography B：Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences，2002，772（1）：99-105.

［20］張艷，吳銀良，胡繼業(yè)，等.高效液相色譜熒光檢測法測定蔬菜中殘留的甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽[J].色譜，2008，26（1）：110-112.

［21］侯曉林，何繼紅，杜向黨，等.牛肝中阿維菌素類藥物殘留的高效液相色譜熒光檢測方法的研究 [J].畜牧獸醫(yī)學報，2006，37（5）：500-503.

［22］熊文山.農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量的檢測技術與方法 [J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2007（5）：50-51.

［23］王彥娟，靳燁，云戰(zhàn)友，等.牛乳中農(nóng)藥殘留的安全性檢測[J].農(nóng)產(chǎn)品加工：學刊，2007（1）：80-82，85.

［24］趙衛(wèi)東，鄭文杰，賀艷，等.酶聯(lián)免疫法檢測動物源性產(chǎn)品中阿維菌素殘留 [J].食品研究與開發(fā)，2009，30（4）：127-129.

［25］Danaher M，O'Keeffe M，Glennon J D.Extraction and isolation of avermectins and milbemycins from liver samples using unmodified supercritical CO2with in-line trapping on basic alumina[J].Journal ofChromatographyB:Biomedical Sciences and Applications，2001，761（1）：115-123.

［26］ Durden D A.Positive and negative electrospray LC-MS-MS methods for quantitation ofthe antiparasitic endectocide drugs，abamectin，doramectin，emamectin，eprinomectin，ivermectin，moxidectin and selamectin in milk[J].Journal of Chromatography：B，2007，850（1/2）：134-146.

［27］ Hernandom，Suareaj，Buenoam，et al.Fast separation liquid chromatography-tandem mass spectmmetry for the confimation and quantitative analysis of avemectin residues in food[J].J chromatogr：A，2007，1155：62-73．

［28］ Sherdan R，Desjardins L.Determination of abamectin doramectin emamectin，Eprinomectin and moxidectin in milk by liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry[J].J AOACInt，2006，89（4）：1088-1094.

［29］楊方，楊守深，林永輝，等.超高效液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法檢測茶葉中阿維菌素類藥物殘留 [J].色譜，2009，27（2）：153-157.

［30］董靜，宮小明，張立，等.QuEChERS-高效液相色譜法檢測蔬菜中的吡蟲啉、蟲酰肼、阿維菌素和噻螨酮[J].分析試驗室，2008，27（3）：91-94.

［31］高華鵬，張健玲，李永夫，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定鰻魚中阿維菌素類農(nóng)藥殘留 [J].質(zhì)譜學報，2008，29（6）：337-342.

［32］趙東豪，賀利民，聶建榮，等.豬肉組織中阿維菌素類藥物殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定 [J].分析測試學報，2008，27（8）：862-865.