流式細(xì)胞術(shù)在蔬菜倍性鑒定中的應(yīng)用

成 妍，馬蓉麗，焦彥生，吳海濤

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，山西太原030032）

蔬菜作物倍性鑒定在遺傳育種中具有十分重要的作用。通過花藥（小孢子）、未受精子房再生出的植株，一般是倍性水平不同的混合群體，進(jìn)行有效的倍性鑒定是了解其遺傳背景和進(jìn)一步應(yīng)用的基礎(chǔ)。倍性鑒定可用來檢測(cè)三倍體無籽西瓜、甜瓜的種子純度。另外，倍性鑒定也可用于細(xì)胞分裂等生理活動(dòng)分析和遺傳效應(yīng)研究。蔬菜作物傳統(tǒng)的倍性鑒定方法有田間植株性狀調(diào)查法、花粉母細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)法、根尖染色體計(jì)數(shù)法、花粉粒大小判別法和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法等。

流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）倍性鑒定是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種以流式細(xì)胞儀為工具的倍性鑒定方法。流式細(xì)胞儀能快速測(cè)量細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)，如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、蛋白質(zhì)、RNA、抗原等，并可對(duì)其分類、收集。FCM借鑒了熒光顯微鏡技術(shù)，同時(shí)利用了計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、電子技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)等多門高新技術(shù)的發(fā)展，將熒光顯微鏡的激發(fā)光源改為激光，使之具有更好的單色性與激發(fā)效率，大大提高了檢測(cè)靈敏度。同時(shí)，將固定的標(biāo)本臺(tái)改為流動(dòng)的單細(xì)胞懸液，用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，大大提高了檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)精確性，而且從同一個(gè)細(xì)胞中可以同時(shí)測(cè)得多項(xiàng)參數(shù)，被譽(yù)為是細(xì)胞分析領(lǐng)域的“CT”[1-2]。

目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)研究領(lǐng)域，但在蔬菜遺傳育種工作中的應(yīng)用還很少。全面、系統(tǒng)地了解流式細(xì)胞術(shù)是十分必要的，因此，筆者對(duì)它的原理、操作步驟、優(yōu)缺點(diǎn)及其在蔬菜作物倍性鑒定中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 流式細(xì)胞術(shù)倍性鑒定的原理

DNA熒光試劑可定量結(jié)合在DNA雙鏈的碳架結(jié)構(gòu)上，細(xì)胞核內(nèi)DNA分子數(shù)目越多，DNA分子鏈越長(zhǎng)，熒光試劑嵌入碳架結(jié)構(gòu)中的量就越多，經(jīng)激光照射，這些DNA猝發(fā)熒光的強(qiáng)度也就越強(qiáng)。因此，在同一條件下，經(jīng)熒光試劑處理的細(xì)胞核DNA所發(fā)熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞核DNA含量的高低[3]。

常用的熒光試劑有PI（碘化丙碇）、PE（藻紅蛋白）、FITC（異硫氰酸熒光素）、PerCP（多甲藻 -葉綠素）和CY5（花青苷）等。

樣本的細(xì)胞群體被分散染色后，在鞘液的包圍和約束下，細(xì)胞排成單列，以1個(gè)細(xì)胞/（m·s）的速度（1 000萬細(xì)胞/h）由流動(dòng)室噴嘴噴出，形成細(xì)胞液柱。當(dāng)液柱通過檢測(cè)區(qū)時(shí)，在入射的激光束垂直照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光，這些熒光信號(hào)的強(qiáng)度代表了所測(cè)細(xì)胞膜表面抗原的強(qiáng)度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度，經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，再通過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號(hào)轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)。計(jì)算機(jī)把測(cè)量到的各種信號(hào)進(jìn)行處理，將分析結(jié)果可顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，也可以打印出來或以數(shù)據(jù)文件的形式存儲(chǔ)在硬盤上，以備日后的查詢或進(jìn)一步分析[4]。

2 流式細(xì)胞術(shù)倍性鑒定的步驟

2.1 樣品制備

將新鮮材料置于含有對(duì)DNA特異性的熒光試劑DAPI或PI緩沖液內(nèi)，用解剖刀切碎（也可以研磨或剪碎），懸浮液經(jīng)20～40 μm尼龍網(wǎng)過濾，調(diào)整細(xì)胞核密度至10萬～30萬個(gè)/mL。

2.2 儀器調(diào)試

打開電源，對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)熱；打開氣體閥，調(diào)節(jié)壓力，獲得適宜的液流速度；開啟光源冷卻系統(tǒng)；在樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng)；利用標(biāo)準(zhǔn)樣品（通常為雞血紅細(xì)胞）進(jìn)行校準(zhǔn)，調(diào)整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調(diào)定的基礎(chǔ)上，0°和90°散射的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，并要求變異系數(shù)為最小。

2.3 上樣測(cè)定

選定流速、測(cè)量細(xì)胞數(shù)、測(cè)量參數(shù)等，在同樣的工作條件下測(cè)量樣品和對(duì)照樣品；選擇計(jì)算機(jī)屏上數(shù)據(jù)的顯示方式，直觀掌握測(cè)量進(jìn)程。樣品測(cè)量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統(tǒng)。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已存入計(jì)算機(jī)硬盤（有的機(jī)器還備有光盤系統(tǒng)，存貯量更大），因此，可關(guān)閉氣體測(cè)量裝置，單獨(dú)使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2.4 結(jié)果分析

由于DNA含量與熒光信號(hào)強(qiáng)度呈正比關(guān)系，細(xì)胞核的倍性最后以C或n值表示，所以，1C表示細(xì)胞核單倍體，2C表示細(xì)胞核二倍體，依此類推。

3 流式細(xì)胞術(shù)倍性鑒定的優(yōu)缺點(diǎn)

流式細(xì)胞術(shù)倍性鑒定可以在短時(shí)間內(nèi)高速分析上萬個(gè)細(xì)胞，同時(shí)對(duì)許多樣本的大量細(xì)胞核DNA含量進(jìn)行測(cè)定，DNA含量變異可在分布圖上直觀地看出。與傳統(tǒng)的熒光鏡、電子顯微鏡檢查相比，其具有速度快、分辨率高、數(shù)據(jù)可重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高，制樣簡(jiǎn)單，試材用量很少（50 mg左右），不影響植物正常生長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，這對(duì)于經(jīng)細(xì)胞融合獲得的多倍體細(xì)胞團(tuán)塊的早期鑒定具有更大的應(yīng)用價(jià)值；采用染色體計(jì)數(shù)只能對(duì)少量細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，無法全面判斷嵌合體的倍性水平，而應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)倍性鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確。

其缺點(diǎn)是：目前國際上還沒有一個(gè)統(tǒng)一的測(cè)量植物核DNA含量的標(biāo)準(zhǔn)作為參照，使用不同的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行DNA絕對(duì)含量測(cè)定，結(jié)果存在誤差；使用不同的核熒光染料檢測(cè)，結(jié)果也有明顯的差異；檢測(cè)費(fèi)用較大，一般育種單位難以承受。

4 流式細(xì)胞術(shù)在蔬菜作物倍性鑒定中的應(yīng)用

Cao等[5]利用流式細(xì)胞儀（Partec CAII CHEM UNEX）鑒定2個(gè)小白菜品種的游離小孢子培養(yǎng)再生植株的倍性，表明2個(gè)群體均有自然加倍單倍體存在，但不同品種的小孢子植株中單倍體比率不同。周元昌等[6]采用德國Partec GmbH公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀以抱子甘藍(lán)的花培苗群體為材料，采用DNA流式細(xì)胞儀測(cè)定法和形態(tài)學(xué)鑒定法鑒定其倍性組成，結(jié)果表明，DNA流式細(xì)胞儀測(cè)定法可鑒別群體的各種倍性水平，而形態(tài)學(xué)鑒別法可把群體中的二倍體與單倍體、四倍體及其他多倍體分開。

顧宏輝等[7]用德國Partec GmbH公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀鑒定早熟菜苔品種油青四九小孢子再生植株的染色體倍性，結(jié)果表明，油青四九再生植株中單倍體比率為14%，自發(fā)二倍體的比率達(dá)到70%，四倍體比率為8%，以及少量的（不到8%）其他多倍體（如三倍體、六倍體）和混倍體（如單倍體加二倍體、二倍體加四倍體）。Gu等[8]對(duì)小白菜和烏塌菜的小孢子后代進(jìn)行流式細(xì)胞儀倍性分析表明，70%以上的再生植株發(fā)生了自然加倍，其中包括自然加倍的四倍體。

陳斌等[9]采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀，應(yīng)用Mod Fit分析軟件對(duì)7個(gè)甜椒F1和3個(gè)辣椒F1的花藥培養(yǎng)的再生株在幼苗期進(jìn)行了倍性鑒定。流式細(xì)胞儀的矩形圖中清楚顯示出每份材料葉片的DNA含量，即檢測(cè)出單倍體、二倍體、三倍體或單倍體加二倍體的混倍體。研究表明，流式細(xì)胞儀可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出試材的染色體倍性，并與坐果結(jié)子的鑒別結(jié)果相一致。韓陽等[10]用德國Partec GmbH公司生產(chǎn)的DNA流式細(xì)胞儀對(duì)大白菜小孢子植株群體的倍性變異進(jìn)行觀察，并以染色體計(jì)數(shù)法的鑒定結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，DNA流式細(xì)胞儀鑒定法的準(zhǔn)確率94.44%，可用于大白菜小孢子群體倍性鑒定。

韓毅科等[11]用FACSCalibur流式細(xì)胞儀對(duì)經(jīng)抗微管除草劑胺磺靈加倍處理過的黃瓜進(jìn)行倍性鑒定，研究表明，與染色體計(jì)數(shù)法相比，用流式細(xì)胞測(cè)定法能迅速測(cè)定黃瓜葉片單個(gè)細(xì)胞核內(nèi)DNA含量，根據(jù)含量的峰值能準(zhǔn)確推斷細(xì)胞的倍性，且流式細(xì)胞術(shù)特別適合離體培養(yǎng)的小植株進(jìn)行倍性鑒定。張振超等[12]利用美國Beckman公司的流式細(xì)胞儀測(cè)定經(jīng)秋水仙素處理過的不結(jié)球白菜倍性，以普通二倍體材料作為對(duì)照，對(duì)照的DNA相對(duì)含量為100，疑似株的DNA為200，表明其是四倍體；疑似株有2個(gè)值，與對(duì)照的比值約為1和2，表明其是嵌合體（2x＋4x）。流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果與染色體計(jì)數(shù)法鑒定結(jié)果一致，表明流式細(xì)胞儀可較準(zhǔn)確地檢測(cè)不結(jié)球白菜突變株的倍性。馬麗華等[13]利用FACSCalibur流式細(xì)胞儀，通過自動(dòng)分析、檢測(cè)細(xì)胞DNA含量的分離峰，來鑒定不結(jié)球白菜小孢子再生植株的染色體倍性，研究發(fā)現(xiàn)，不結(jié)球白菜自然加倍率很高，且倍性變異情況比較復(fù)雜，其中，四倍體植株占比例最高，達(dá)到56.39%；二倍體植株占39.10%；三倍體植株占3.01%；而單倍體植株僅占1.50%。

成妍等[14]采用美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics XL型流式細(xì)胞儀測(cè)定不結(jié)球白菜小孢子再生植株的DNA含量，以普通二倍體材料作為對(duì)照，結(jié)果表明，不結(jié)球白菜小孢子再生植株自然加倍率總體水平較高，有的高達(dá)90%，但不同基因型間有明顯差異。鄧耀華等[15]先利用流式細(xì)胞儀對(duì)甘藍(lán)小孢子植株進(jìn)行倍性鑒定，以此作為依據(jù)，再利用普通光學(xué)顯微鏡觀察已通過倍性鑒定的雙單倍體與單倍體的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞，測(cè)定其大小與葉綠體數(shù)，研究表明，氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)是鑒定甘藍(lán)小孢子植株倍性的簡(jiǎn)易有效手段。

方淑桂等[16]采用德國Partec GmbH公司生產(chǎn)的PA-I流式細(xì)胞儀對(duì)不同熟性的大白菜小孢子植株群體的倍性變異進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，小孢子植株是倍性水平不同的混合群體，不同熟性的大白菜小孢子植株群體的倍性分布不同，中晚熟大白菜小孢子植株雙單倍體比例最高，春大白菜最低。周志國等[17]使用德國Partec GmbH公司的流式細(xì)胞儀對(duì)蘿卜游離小孢子再生植株的葉片和莖等進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)小孢子誘導(dǎo)出的植株中同時(shí)出現(xiàn)了單倍體、雙單倍體、四倍體植株。與父母本相比，單倍體的峰值出現(xiàn)在75附近，二倍體的峰值出現(xiàn)在150附近，四倍體峰值出現(xiàn)在300附近。施先鋒等[18]采用德國Partec GmbH公司的PA-I流式細(xì)胞儀對(duì)西瓜倍性進(jìn)行早期鑒定，結(jié)果顯示，二倍體植株主峰熒光強(qiáng)度位于50 AU，而四倍體主峰熒光強(qiáng)度位于100 AU，說明四倍體植株細(xì)胞DNA含量為二倍體的2倍。

5 展望

迄今，流式細(xì)胞術(shù)已應(yīng)用于多種蔬菜作物倍性鑒定，與其他傳統(tǒng)鑒定方法相比具有不可替代的優(yōu)勢(shì)，流式細(xì)胞術(shù)被認(rèn)為是最有前途的倍性鑒定方法。隨著相關(guān)研究的不斷深入，這項(xiàng)技術(shù)將會(huì)越來越完善，應(yīng)用會(huì)更加方便、快捷，檢測(cè)結(jié)果會(huì)更加準(zhǔn)確。

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