白細(xì)胞介素12的研究概況與進(jìn)展

王 燦，黎曉敏，彭遠(yuǎn)義

（西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶 北碚 400716）

細(xì)胞因子是由細(xì)胞分泌的一類能在細(xì)胞間傳遞信息、具有多種生物學(xué)效應(yīng)的蛋白質(zhì)或小分子多肽，主要包括干擾素、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素和集落刺激因子等。IL-12是1990年由美國(guó)的Stern等人發(fā)現(xiàn)的一個(gè)細(xì)胞因子，最初根據(jù)其生物學(xué)基本功能將它稱為自然殺傷細(xì)胞刺激因子或細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞成熟因子。1991年Gubler等成功克隆表達(dá)了CLMFcDNA，并將其命名為白細(xì)胞介素-12（IL-12）。此后學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn)IL-12具有多種生物學(xué)活性，在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗感染等方面具有很重要的作用，顯示了它作為免疫佐劑應(yīng)用于疫苗中的前景。本文從IL-12的分子結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)、產(chǎn)生及來源、生物學(xué)功能、臨床應(yīng)用現(xiàn)狀和基因的克隆與表達(dá)等幾個(gè)方面作如下綜述。

1 IL-12的分子結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)

具有生物活性的天然IL-12是一種分子量為75kD的糖蛋白，是由40kD和35kD兩個(gè)亞基（p40和p35）依靠二硫鍵組成的異二聚體（p70），也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一由兩個(gè)不同亞基組成并呈異二聚體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞因子，也就是說p35和p40兩者單獨(dú)存在時(shí)無生物學(xué)作用，只有以異二聚體方式結(jié)合為p70后才具有生物學(xué)活性。除具生物活性的異二聚體p70外，IL-12還能以（p40）2同聚物形式被過量分泌，它是p70的天然拮抗劑，能與IL-12受體結(jié)合從而阻斷p70與受體結(jié)合發(fā)揮生物活性。IL-12中的p40基因定位于染色體5q31-33，p35基因位于染色體3q12-13.2。

蘭文升等于2002年在國(guó)內(nèi)首次克隆了豬IL-12。序列分析表明p35基因開放閱讀框序列與人、小鼠和羊的同源性分別為79.2%、37.6%、86.1%，p40基因開放閱讀框序列與人、小鼠和羊的同源性分別為79.5%、53.1%、84.3%。Dante等于1995年擴(kuò)增了編碼牛IL-12的cDNA序列，分析后表明牛p40和p35亞基的氨基酸序列與人和小鼠的同源性分別為84.4%、67.6%和82.2%、58.6%。由以上可知，IL-12在各種屬間的同源性普遍較低，因此存在種屬特異性。

2 IL-12的產(chǎn)生及來源

IL-12主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，部分來自樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、郎格罕氏細(xì)胞等。有研究表明，在很多組織中如淋巴組織（脾、胸腺、骨髓）、非淋巴組織（肝、腎、肌肉）均能表達(dá)IL-12，而在受到刺激的淋巴組織中可見IL-12的高水平表達(dá)。在體外條件下，LPS、ConA、PHA能誘導(dǎo)脾細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-12。A.Premraj等（2006）發(fā)現(xiàn)p35和p40亞基均可在脾臟細(xì)胞中表達(dá)，但p40亞基的表達(dá)量在脾臟受到刺激后8～24h內(nèi)有所升高，而p35亞基的表達(dá)量沒有波動(dòng)。

3 IL-12的生物學(xué)功能

3.1 對(duì)T、NK等免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用 IL-12能增強(qiáng)NK/LA K細(xì)胞的溶菌活性，作為活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞的生長(zhǎng)因子促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖。IL-12可明顯刺激靜止的或激活外周血T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞分泌IFN-γ，并與IL-12協(xié)同作用，但靜止的細(xì)胞需要輔助T細(xì)胞的參與。IFN-γ的產(chǎn)生反過來活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多的IL-12，形成二者的正反饋途徑，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞亞群分化。IL-12還能促進(jìn)T細(xì)胞表達(dá)CD40L，使T細(xì)胞通過CD40L與B細(xì)胞上的CD40L相互作用，從而促進(jìn)B細(xì)胞的分裂增殖；同時(shí)IL-12可使增殖的B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞并分泌IgM，增強(qiáng)體液免疫。

3.2 對(duì)Th1細(xì)胞的誘導(dǎo)和對(duì)Th2細(xì)胞的抑制作用 在人體和鼠，已證明IL-12是Th1產(chǎn)生的必需因子，它可促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化和功能的提高，同時(shí)抑制由IL-4介導(dǎo)的Th2細(xì)胞的分化。在體外用過敏原作用于CD4+細(xì)胞后生成Th2型細(xì)胞，后者可分泌高濃度IL-4和低濃度IFN-γ；但當(dāng)有IL-12存在時(shí)，則生成Th1細(xì)胞，只分泌IFN-γ，而不分泌IL-4。因此，IL-12和IL-4分別支持Th1和Th2細(xì)胞的分化。通過一定的正負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ可進(jìn)一步增加單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-12，減少IL-10產(chǎn)生；Th2分泌的IL-4和IL-10則抑制IL-12的產(chǎn)生。另外，IFN-γ可增強(qiáng)Tc細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷活性，并通過抑制Th2細(xì)胞下調(diào)體液免疫，使Th細(xì)胞的分化向Th1方向進(jìn)行。Th1細(xì)胞在細(xì)胞免疫中尤其是在宿主抗胞內(nèi)細(xì)菌感染中起重要作用。由此可見，IL-12通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中發(fā)揮了積極作用。

4 IL-12的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

4.1 抗腫瘤 IL-12增強(qiáng)NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞的免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生IFN-γ，表明它可能具有抗腫瘤作用。目前應(yīng)用IL-12基因治療黑色素瘤、乳腺癌、腎癌、消化道惡性腫瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等晚期腫瘤已在臨床I、II期中可見，并取得了一定的療效，且未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。

Lenoard等（1997）用rhIL-12進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)，在腫瘤和感染患者中按劑量遞增給予IL-12，結(jié)果顯示rhIL-12在500 ng/kg時(shí)安全。但在II期臨床試驗(yàn)中，12例患者中出現(xiàn)2人死亡，說明藥物的耐受性與劑量有關(guān)。Portielje等通過對(duì)晚期腎癌患者使用rhIL-12進(jìn)行臨床Ⅰ期研究，觀察到相同劑量時(shí)首次注射的不良反應(yīng)要比再次注射嚴(yán)重。rhIL-12首次給藥的最大耐受劑量（MTD）是500ng/kg，再次給藥的MTD是1000mg/kg。在治療過程中，第1d使用rhIL-12后間隔7d，到第8d開始重復(fù)使用rhIL-12，每周3次，連續(xù)2周，活檢顯示IL-12和IFN-γ在血中的濃度上升，證明瘤內(nèi)注射質(zhì)粒DNA產(chǎn)生了有益的臨床效果。在最近的研究中，將IL-12基因與其他基因聯(lián)合應(yīng)用，通過相互間的協(xié)同或疊加效應(yīng)來治療腫瘤，這已成為一個(gè)重要的發(fā)展方向。

4.2 抗病毒感染 IL-12對(duì)多種類型病毒的復(fù)制和表達(dá)都具有抑制作用，它可通過增強(qiáng)病毒感染后的特異性和非特異性免疫應(yīng)答來發(fā)揮抗病毒作用。IL-12可以增強(qiáng)病毒感染組織中MHCⅠ、Ⅱ類抗原的表達(dá)，而由IL-12刺激的NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞對(duì)病毒感染細(xì)胞清除的第一步即是對(duì)MHC限制性病毒感染細(xì)胞的識(shí)別，因此IL-12是調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)的關(guān)鍵分子。杜德偉等用HBV DNA疫苗（PCR3.1-S）與編碼小鼠IL-12的真核表達(dá)載體共同免疫小鼠，然后測(cè)定CTL細(xì)胞殺傷活性，結(jié)果顯示有IL-12組的CTL殺傷活性顯著高于無IL-12組。說明IL-12的真核表達(dá)載體能提高小鼠對(duì)HBV DNA疫苗的免疫應(yīng)答，可以用于抵御乙型肝炎病毒的感染。

4.3 抗寄生蟲 因IL-12能夠誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)向Th1型優(yōu)勢(shì)分化，在細(xì)胞免疫中起重要作用，所以在抗血吸蟲感染方面也有重要作用。喻鑫玲等用SjCTPIHsp70與IL-12聯(lián)合免疫水牛，對(duì)于水牛血吸蟲的感染有一定的免疫保護(hù)性作用。

5 IL-12基因的克隆與表達(dá)

p35和p40兩者單獨(dú)存在時(shí)無生物學(xué)作用，只有以異二聚體方式等比例結(jié)合后才具有生物學(xué)活性。許多研究者為解決該問題，在IL-12克隆表達(dá)時(shí)采取了不同策略以實(shí)現(xiàn)雙亞基的同步表達(dá)。到目前為止，人、鼠、牛、豬等多種動(dòng)物的IL-12均已可以通過病毒、質(zhì)粒等載體在原核與真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，且具有生物活性，為IL-12在免疫和治療方面的應(yīng)用奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

夏向文等采用重疊PCR的方法成功構(gòu)建了攜帶報(bào)告基因（GFP）和人IL-12 p35、p40亞基基因的重組真核質(zhì)粒pEGFP-C1_IL-12，并在人肝癌細(xì)胞系HepG2中成功表達(dá)。他們首先分別擴(kuò)增出p35和p40亞基基因，設(shè)計(jì)兩亞基引物時(shí)在p40的下游引物和p35的上游引物中分別加入p35和p40的部分互補(bǔ)序列，從而實(shí)現(xiàn)了采用重疊PCR的方法連接兩個(gè)亞基基因得到全長(zhǎng)串聯(lián)基因的目的。

理想的基因轉(zhuǎn)移載體是IL-12在臨床中進(jìn)一步應(yīng)用的關(guān)鍵。病毒載體的轉(zhuǎn)染效率高，但制備成本也高，過程煩瑣，且體內(nèi)免疫原性強(qiáng)，妨礙載體的重復(fù)注射。相比之下質(zhì)粒載體成本低且制備簡(jiǎn)便，但其轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低。考慮到如上問題，李曉敏等利用1999年出現(xiàn)的水流動(dòng)力學(xué)注射方法將表達(dá)小鼠IL-12的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi)，從而解決了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低的問題。

6 應(yīng)用前景

傳統(tǒng)的疫苗免疫手段仍然存在問題，比如弱毒疫苗存在可能的安全問題，滅活疫苗雖然安全但其免疫效力不甚理想，DNA疫苗具有良好的發(fā)展前途但仍需不斷完善。IL-12因其獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用，十分適合作為免疫佐劑改良現(xiàn)有的DNA疫苗，尤其針對(duì)細(xì)胞免疫，對(duì)提高機(jī)體抗感染能力的效果良好。另外，IL-12也可用于對(duì)腫瘤等疾病的治療，但治療時(shí)的用量、使用時(shí)間等都有待進(jìn)一步研究。

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