衣霉素對RPMI-8226細胞分化的影響

譚建軍，林 榮，侯俊丞，董浦江

(1.川北醫(yī)學院附屬三臺醫(yī)院血液內科，四川三臺 621100;2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，重慶市普外科學重點實驗室，重慶 400016)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是起源于B細胞的惡性腫瘤。好發(fā)于中老年人，以骨痛為主要臨床表現(xiàn)［1］。誘導分化治療多發(fā)性骨髓瘤是一新的治療領域。衣霉素(tunicqamycin，TM)是一核苷抗生素，它可通過抑制蛋白糖基化途徑中的十四糖二磷酸長萜醇的生成，形成脫糖蛋白，阻礙內質網(wǎng)內新生蛋白質糖基化修飾，內質網(wǎng)中鈣離子紊亂和未折疊蛋白蓄積，引起具有保護作用的未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)發(fā)生［2］。UPR在具有分泌抗體的細胞分化中有著重要作用。本實驗在重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院重慶市普外科學重點實驗室完成，我們以小劑量TM誘導RPMI-8226細胞，探討TM在誘導分化治療多發(fā)性骨髓瘤中的機理，為臨床應用提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

鼠抗人XBP-1u蛋白抗體、兔抗人CD49e抗體、兔抗人β-actin蛋白抗體(美國Santa cruz公司)，衣霉素(美國sigma公司)，測定免疫球蛋白輕鏈ELIAS試劑盒(美國GE公司)，APAAP試劑盒(醫(yī)學科學院生物制劑中心)，電泳試劑盒(武漢博士得公司)，發(fā)光試劑盒(美國GE公司)，蛋白提取液(武漢博士得公司)，圖像分析系統(tǒng)(美國BID-RAD公司Chemi DOCXRS)。

1.2 RPMI-8226細胞

為多發(fā)性骨髓瘤細胞株，購自中國醫(yī)科院細胞庫。用含10%FBS的1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，成對數(shù)生長期時用于實驗。實驗組加TM，其終濃度0.4μmol/L，分別繼續(xù)培養(yǎng)48小時與72小時。對照組加TM溶劑。

1.3 RPMI-8226細胞CD49e表達率測定

2%胰酶消化實驗組及對照組細胞，將細胞滴加在多聚賴氨酸打底的載玻片上，推片，涼干后，CD49e抗體1∶100稀釋，具體按APAAP試劑盒說明書進行操作，每張玻片在200倍光鏡下，計數(shù)上、下、左、右四個區(qū)域，100個細胞中呈棕色之細胞數(shù)，一式三份。

1.4 RPMI-8226細胞培養(yǎng)液中免疫球蛋白測定

12000r/min離心收集上述實驗及對照組細胞培養(yǎng)液，按ELIAS試劑盒說明書進行測定，一式三份。

1.5 XBP-1u蛋白表達測定

用細胞刮刮取上述實驗組與對照組的RPMI-8226細胞，置EP管內，震蕩混勻后置4℃、30分鐘，取勻漿置離心管中12000r/min離心20分鐘。取上清液測定蛋白含量，爾后用蛋白提取液將蛋白濃度均調至3mg/ml。將該組織液經(jīng)100g/L SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳，電轉于PVDF膜，50g/L脫脂奶粉的TBST溶液封閉，經(jīng)一抗及二抗孵育后，化學發(fā)光法顯色，圖像分析系統(tǒng)拍攝并用Quantity One軟件將特異條帶灰度數(shù)字化。

XBP-1u表達水平的相對值(XBP-1u蛋白表達系數(shù))為XBP-1u蛋白條帶灰度與內參蛋白β-actin蛋白條帶灰度比值。(XBP-1u蛋白表達系數(shù)=XBP-1u蛋白積分光密度/β-actin蛋白積分光密度)。

1.6 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，實驗結果采用均數(shù)±標準差(x－±s)描述，三組資料各指標的比較采用單因素方差分析，兩輛比較采用SNK法。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RPMI-8226細胞CD49e表達率

對照組細胞CD49e表達率為7.8% ±2.3%，衣霉素處理48小時實驗組CD49e表達率為25.3%±3.1%，衣霉素處理72小時實驗組CD49e表達率為43.6% ±3.3%，對照組與兩實驗組有顯著差異(p＜0.01)。

2.2 RPMI-8226細胞培養(yǎng)液中免疫球蛋白:

對照組培養(yǎng)上清液免疫球蛋白輕鏈含量為(182±25)mg/L，衣霉素處理48小時實驗組為(311±19)mg/L，衣霉素處理72小時實驗組為(405±23)mg/L。對照與兩實驗組差異均有顯著性(p＜0.01)。

2.3 XBP－1u蛋白表達

對照組、衣霉素處理48小時、72小時實驗組XBP-1u蛋白表達，見圖1。對照組XBP-1u蛋白表達系數(shù)為0.16±0.10，衣霉素處理48小時實驗組XBP-1u蛋白表達系數(shù)為0.53±0.17，衣霉素處理72小時實驗組 XBP-1u蛋白表達系數(shù)為0.93±0.15。對照與兩實驗組差異均有顯著性(p＜0.01)。

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是骨髓內漿細胞異常增生的一種惡性腫瘤，目前鮮有有效的治療手段［3］。尋找安全有效的誘導分化治療多發(fā)性骨髓瘤具有重要的臨床意義。真核細胞的內質網(wǎng)承擔著新生蛋白質的折疊、組裝和運轉，某些疾病時會產(chǎn)生未折疊或錯誤折疊蛋白，人類和小鼠細胞內存在一種機制，即通過調整內質網(wǎng)折疊蛋白的數(shù)量與加強折疊能力緩解內質網(wǎng)壓力，該機制即UPR，UPR可用于保持內質網(wǎng)內穩(wěn)定和阻止細胞凋亡，這機制可能是多種疾病的病原學基礎［4］。有文獻報道UPR在分泌抗體的細胞(如漿細胞)分化中起重要作用［5］。X盒結合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP1)作為一個轉錄因子參與 UPR的調節(jié)［6］。XBP-1s與 XBP-1u分別是XBP-1的剪切體與未剪切體，分別由376及260個氨基酸組成。有研究者［7］發(fā)現(xiàn)XBP-1s在骨髓瘤原代細胞中較正常漿細胞表達高，并在轉基因小鼠的實驗模型中發(fā)現(xiàn)XBP-1s可促進小鼠骨髓瘤的發(fā)病，故認為XBP-1s與骨髓瘤的發(fā)病相關。作者用衣霉素處理 RPMI-8226細胞后，RPMI-8226細胞的CD49e陽性率增加，其培養(yǎng)液中的免疫球蛋白輕鏈含量增高，且該現(xiàn)象隨處理時間延長而更明顯。CD49e陽性的骨髓瘤細胞是成熟細胞，能分泌更多的免疫球蛋白。該現(xiàn)象說明RPMI-8226細胞經(jīng)小劑量衣霉素處理后，向成熟階段分化。同時處理后的RPMI-8226細胞XBP-1u蛋白表達增高，XBP-1u可激活哺乳動物體內UPR，在UPR中起反饋調節(jié)，與細胞的分化相關［8］，顯示該細胞向成熟階段分化與XBP-1u蛋白表達增高引發(fā)UPR相關。綜上所述，用小劑量的UPR誘導劑－衣霉素可使RPMI-8226細胞RPMI-8226細胞的XBP-1u蛋白表達增高，從而誘導該細胞向成熟細胞轉化。

針對UPR途徑靶向治療多發(fā)性骨髓瘤是一新的治療途徑［9］。本實驗結果亦顯示該方法具有應用前景。

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