酶聯(lián)免疫法檢測生乳中三聚氰胺的研究

三聚氰胺又名氰尿酰胺，學(xué)名三氨三嗪（C3H6N6），俗稱密胺、蛋白精，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，常被用作化工原料。三聚氰胺是一種非蛋白質(zhì)含氮化合物，屬于難代謝物質(zhì)，一旦進(jìn)入人體或動(dòng)物體內(nèi)，能夠不同程度地導(dǎo)致腎衰竭或者是死亡，還能導(dǎo)致結(jié)石誘發(fā)膀胱和泌尿系統(tǒng)疾病。但是，由于其含氮量高達(dá)66.67%，不法商販抓住這一特點(diǎn)，向乳制品及飼料中添加三聚氰胺作為偽蛋白以提高產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量，對食品安全造成很大危害。

近年來，發(fā)生在國內(nèi)的“三鹿牌嬰幼兒奶粉事件”以及美國的數(shù)起飼料致死寵物的事件，使三聚氰胺的檢測成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)。目前，國際食品法典委員會(huì)對食品中三聚氰胺的允許含量設(shè)立了新的標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：嬰兒配方奶粉中三聚氰胺含量不得超過1 mg/kg，而其他食品或動(dòng)物飼料中的三聚氰胺含量不得超過2.5 mg/kg。因此，如何高效快速地檢測食品中三聚氰胺的含量成為保護(hù)消費(fèi)者生命安全至關(guān)重要的問題。

目前，生乳與乳制品中三聚氰胺殘留量檢測的方法主要有液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（LC-MS/MS）、氣相色譜——質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS和GC-MS/MS）?？焖贆z測法主要包括酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫層析法等，其中，酶聯(lián)免疫法被廣泛應(yīng)用于三聚氰胺檢測的篩選實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)利用酶聯(lián)免疫法對生乳進(jìn)行了三聚氰胺含量的檢測，為摸索三聚氰胺快速有效的檢測方法提供了參考。

圖1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

酶標(biāo)儀（北京朗普新技術(shù)有限公司）；渦旋混合器（上海青浦滬西儀器廠）；生化培養(yǎng)箱（寧波萊福科技有限公司）；微量移液器（瑞寧）；單道計(jì)時(shí)器；三聚氰胺酶聯(lián)免疫試劑盒（北京望爾生物技術(shù)有限公司）；乙腈（分析純）。

1.2 工作液配制

1.2.1 復(fù)溶工作液

用去離子水將2×濃縮復(fù)溶液按1:1體積比稀釋（1份2×濃縮復(fù)溶液+1份去離子水），用于樣本的復(fù)溶。

1.2.2 洗滌工作液

用去離子水將20×濃縮洗滌液按1:19體積比稀釋（1 份20×濃縮洗滌液+19 份去離子水），用于酶標(biāo)板的洗滌。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

（1）取出生乳樣品（編號(hào)1～25），待其至室溫（25±2 ℃）后，搖勻。分別取400 μL生乳于離心管中，加入800 μL乙腈，渦動(dòng)1 min。取100 μL上清液，再加入500 μL復(fù)溶工作液，混勻，取50 μL進(jìn)行檢測。

（2）另取3 份空白生乳樣品（經(jīng)實(shí)驗(yàn)室液相檢測及氣質(zhì)聯(lián)用確證后三聚氰胺含量為0的樣品）400 μL，分別向其中加入10 μg/mL的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品0、20和50 μL，分別作為空白對照和2 個(gè)陽性添加（0.5、1.25 μg/mL）組，加入800 μL乙腈，渦動(dòng)1 min。取100 μL上清液，再加入500 μL復(fù)溶工作液，混勻，取50 μL進(jìn)行檢測。

1.3.2 檢測

（1）將所需試劑拿出，置于室溫（25±2 ℃）平衡30 min以上。取出實(shí)驗(yàn)所需酶標(biāo)板條，插入酶標(biāo)板架上，未使用的酶標(biāo)板條用自封袋密封后，立即保存于2～8 ℃的環(huán)境中。

（2）編號(hào)：將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)酶標(biāo)板孔按序編號(hào)，每個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品做2 個(gè)平行孔，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔所在的位置。

（3）將50 μL各標(biāo)準(zhǔn)品工作液（樣品溶液）分別加入對應(yīng)的微孔中，每個(gè)孔中再加入50 μL酶標(biāo)二抗工作液，最后加入50 μL抗體工作液，輕輕震蕩混勻。蓋好蓋板膜置于25 ℃培養(yǎng)箱中，避光反應(yīng)30 min。

（4）洗板：揭開蓋板膜，甩干孔中液體，用洗滌工作液250 μL/孔，充分洗滌4～5 次，每次間隔10 s，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，拍干。

（5）顯色：加入底物A液50 μL/孔，再加底物B液50 μL/孔，輕輕震蕩混勻，蓋好蓋板膜置于25 ℃培養(yǎng)箱中，避光反應(yīng)15 min。

（6）測定：揭開蓋板膜，在每個(gè)孔中加入50 μL終止液，輕輕震蕩混勻。用酶標(biāo)儀在雙波長450 nm、630 nm下檢測吸光度值，結(jié)果在終止后5 min內(nèi)讀取。

表1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測結(jié)果

表2 樣品檢測結(jié)果

表3 空白對照及陽性添加樣品回收率測定結(jié)果

1.3.3 計(jì)算

（1）百分吸光率的計(jì)算

各標(biāo)準(zhǔn)品（樣品）的平均吸光度值除以零標(biāo)平均吸光度值，再乘以100%，可以得到各標(biāo)準(zhǔn)品（樣品）對應(yīng)的百分吸光率。公式如下：

百分吸光率（%）=（標(biāo)準(zhǔn)品的平均吸光度值/零標(biāo)的平均吸光度值）×100%

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品所對應(yīng)的濃度，乘以其相對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即得到樣品中三聚氰胺的實(shí)際濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

所測得的標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值及百分吸光率如表1所示。按上述方法計(jì)算，繪制成三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。同一組標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的離散系數(shù)均小于3%，說明本實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好，符合試劑盒規(guī)定，而且各標(biāo)準(zhǔn)品與曲線的變異偏差小于0.4%，可見此標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確率較高，依此曲線所測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.2 樣品及回收率測定結(jié)果

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可測得樣品中三聚氰胺含量，空白對照結(jié)果及陽性添加樣品回收率如表2、3所示。

從以上兩表的結(jié)果顯示，同一組樣品的吸光度值的離散系數(shù)均小于10%，說明重復(fù)性很好。用陰性奶樣作為陰性空白對照，并用不同濃度的三聚氰胺添加，作為陽性添加回收率的測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。空白對照組所得三聚氰胺含量為零，而2 個(gè)陽性添加樣品所得平均回收率為97.7%，結(jié)果也比較理想，說明此實(shí)驗(yàn)的前處理方法及操作過程可信度較高，所得樣品的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：嬰兒配方奶粉中三聚氰胺含量不能超過1 mg/kg，而其它食品或動(dòng)物飼料中的三聚氰胺含量不能超過2.5 mg/kg。當(dāng)三聚氰胺含量高于2.5 mg/kg即判定為陽性，表2中所示的26 個(gè)生乳樣品中，三聚氰胺濃度均未超過68 μg/mL，其中20 號(hào)樣品所測吸光度值高出零標(biāo)吸光度值，出現(xiàn)超陰性現(xiàn)象，可能與奶牛的品種及體質(zhì)不同有關(guān)。所測樣品均符合國家規(guī)定，說明相關(guān)部門加大了對生乳環(huán)節(jié)的監(jiān)管力度，使得違法添加現(xiàn)象大大減少。

3 討論

3.1 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行生乳中三聚氰胺含量的檢測，具有快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高等特點(diǎn)。當(dāng)檢測量較大時(shí)，可以用酶聯(lián)免疫吸附法先進(jìn)行篩選，然后再用其它方法加以確證，這樣可以大大節(jié)省時(shí)間和工作量，也有利于降低檢測成本。

3.2 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，溫度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響相當(dāng)大。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將樣品及試劑盒充分的溫度控制在室溫25 ℃，實(shí)驗(yàn)中溫度保持在室溫，所有孵育要在25 ℃恒溫箱中進(jìn)行，而且要避免光線照射，用蓋板膜封好微孔板。

3.3 為避免交叉污染，在吸取不同試劑及樣品時(shí)需要更換吸頭。

3.4 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是測定程序中的要點(diǎn)。洗板過程中應(yīng)避免出現(xiàn)板孔干燥的現(xiàn)象，排干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作，以防曲線不成線性、重復(fù)性不好的現(xiàn)象出現(xiàn)。

3.5 試劑盒應(yīng)保存于2～8 ℃，光線無法直射的環(huán)境中，使用后，應(yīng)立即將所有試劑放回儲(chǔ)存環(huán)境下。不要使用過期的試劑盒及試劑，不同批次的試劑盒不能交叉使用，否則會(huì)影響結(jié)果的靈敏度及準(zhǔn)確性。

[1]薛樹科，宋金鳳，時(shí)麗艷，等. 乳制品中三聚氰胺檢測研究進(jìn)展. 河北化工，2010，33（9）：21-23.

[2]黃義彬，鄭麗，歐翔，等. 高效液相法測定雞蛋中三聚氰胺的殘留量. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（6）：221-223.