高速逆流色譜制備分離紫甘薯花色苷

摘 要 采用高速逆流色譜法分離純化紫甘薯花色苷。以正丁醇-乙酸乙酯-0.5%乙酸 （3∶1∶4，V/V）為溶劑體系，上相為固定相，下相為流動相，流速2 mL/min，進樣量300 mg，分離得到兩種花色苷的混合物；混合物再以0.2% 三氟乙酸-正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈（6∶5∶2∶1，V/V）為溶劑體系，上相為固定相，下相為流動相，流速1.5 mL/min，進樣量100 mg，分離得到純度分別為98.5%和96.7% 的兩個花色苷單體組分。通過紫外-可見光譜、質(zhì)譜、核磁等技術(shù)進行結(jié)構(gòu)鑒定，確定組分1為3-O-{6-O-（E）-咖啡酰-2-O-［6-O-（E）-對羥基苯甲酰-β-D-吡喃葡糖基］-β-D-吡喃葡糖苷}-［5-O-（β-D-吡喃葡糖苷）］芍藥素，組分2為3-O-{6-O-（E）-咖啡酰-2-O-［6-O-（E）-阿魏酰-β-D-吡喃葡糖基］-β-D-吡喃葡糖苷}-［5-O-（β-D-吡喃葡糖苷）］芍藥素。實驗從450 g紫甘薯中獲得63 mg組分1和48 mg組分2，為紫甘薯花色苷分離提供了高效、穩(wěn)定、可靠的方法。

關(guān)鍵詞 紫甘薯； 花色苷； 高速逆流色譜； 制備分離

2010-09-29收稿；2011-01-13接受

本文系湖南省重大科技專項（No.NK07006）資助

* E-mail：larkin-liu@163.com

1 引 言

紫甘薯［ Ipomoea batatas （L.） Lam.］屬旋花科一年生草本植物。20世紀(jì)90年代初，日本首先在甘薯中篩選出花色苷含量較高的紫甘薯品種，我國近年來也已著手紫甘薯新品種的選育。研究表明，其塊根富含的花色苷類化合物，具有抗氧化、清除自由基［1，2］、調(diào)節(jié)血糖［3］、減輕肝功能障礙、促進肝損傷恢復(fù)［4，5］、抗突變［6］以及抑菌［7］等多種生理活性。此外，紫甘薯花色苷多具有?；Y(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性明顯強于其它種類花色苷，具有更好的開發(fā)利用前景。目前，關(guān)于紫甘薯花色苷上述生理活性的研究結(jié)果多來自花色苷粗提物，其作用機理不明確，質(zhì)量控制也缺少標(biāo)準(zhǔn)品。因此，建立紫甘薯花色苷單體化合物的高效制備技術(shù)對進一步作用機理研究及產(chǎn)品質(zhì)量控制具有重要意義。

采用紙色譜、薄層色譜、凝膠色譜等多種技術(shù)聯(lián)用［8，9］，可從不同品種紫甘薯中分離出多種花色苷單體，但操作繁瑣、重現(xiàn)性差、易造成目標(biāo)組分的不可逆吸附和變性，不適于大量制備。高速逆流色譜（HSCCC）是一種不使用固體吸附劑的液-液分配色譜技術(shù)，避免了樣品的不可逆吸附，操作簡單、制備量大，廣泛應(yīng)用于天然活性成分的制備分離［10～12］。本研究建立了國產(chǎn)紫甘薯中花色苷高效、快捷、穩(wěn)定的HSCCC制備方法，獲得了兩種酰基化花色苷單體，采用紫外-可見光譜、質(zhì)譜、核磁等技術(shù)進行了結(jié)構(gòu)鑒定。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

TBE-300A型高速逆流色譜儀（中國上海同田生化技術(shù)有限公司），配有TBD-2000紫外檢測器、TBP-50A 恒流泵；LX-300 恒溫器（北京長流科技儀器公司）；LC-20AT 高效液相色譜（日本島津公司）， 配有SPD-M20A 檢測器，WondasilTM C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5

SymbolmA@ m）； MODULYOD-230冷凍干燥機（美國熱電公司）；LXQ 線性離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀（美國熱電公司），配備Surveyor 液相色譜系統(tǒng)；核磁共振儀器（美國瓦里安公司）。

乙腈（色譜純，國藥集團化學(xué)試劑公司）；乙酸乙酯、正丁醇和甲醇（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑公司）；甲基叔丁基醚（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；HP2MGL 大孔吸附樹脂（日本三菱化學(xué)有限公司）；廣紫薯135購于廣東省農(nóng)科院。

2.2 高效液相色譜（HPLC）條件

WondasilTM C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5

SymbolmA@ m）。流動相：0.2% H3PO4（A）-乙腈（B）； 洗脫程序： 0～30 min，15%～25% B； 流速 1.0 mL /min； 二極管陣列檢測器，柱溫 30 ℃。

2.3 高速逆流色譜（HSCCC）進樣原料的制備

新鮮紫甘薯切片，置45℃烘箱中干燥后粉碎。取 450 g 加入 3600 mL 60% 乙醇（以HCl調(diào)至pH 3），避光常溫浸提 24 h，濾渣同法再提取一次，合并提取液，減壓濃縮至無醇味（約 500 mL），用乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯層無色，水相減壓蒸餾除去殘留的乙酸乙酯后通過HP2MGL大孔吸附樹脂柱（60 cm×3 cm，樹脂 350 mL）， 依次用4 倍柱床體積的30%和90% 乙醇洗脫，收集 90% 乙醇洗脫部分， 40 ℃ 減壓濃縮后冷凍干燥，得紫甘薯花色苷純化產(chǎn)品 3 g， 冷藏保存?zhèn)溆?，作為HSCCC的進樣原料。

2.4 HSCCC制備分離過程

2.4.1 HSCCC第一次分離 按正丁醇-乙酸乙酯-0.5% 乙酸 （3∶1∶4， V/V）配制溶劑體系，上相為固定相，下相為流動相，流速 2 mL/min，轉(zhuǎn)速 850 r/min，溫度 25 ℃，檢測波長 280 nm，取2.3節(jié)所制備的樣品 300 mg 溶于20 mL下相溶劑中，注入HSCCC。根據(jù)峰形手動收集 270～315 min流出液，40 ℃減壓濃縮后冷凍干燥，置冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 HSCCC第二次分離

以 0.2%三氟乙酸-正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈（6∶5∶2∶1， V/V）為溶劑體系，流速1.5 mL/min，取2.4.1節(jié)所制樣品100 mg 溶于20 mL下相溶劑中，注入HSCCC，進行第二次分離，其它條件同2.4.1節(jié)。分別收集205～220 min和240～275 min流出液，40 ℃減壓濃縮后冷凍干燥。

第6期陸 英等： 高速逆流色譜制備分離紫甘薯花色苷

2.5 結(jié)構(gòu)鑒定

采用UV-Vis， MS， 1H NMR和13C NMR鑒定兩個組分的結(jié)構(gòu)。UV-Vis方法見文獻［9］；質(zhì)譜采用HESI-Ⅱ電噴霧電離源，正離子模式，數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)多級質(zhì)譜全掃描； NMR樣品用CD3OD溶解，頻率為300 MHz。

3 結(jié)果與討論

3.1 HPLC方法的建立及優(yōu)化

花色苷在280和530 nm 處均有較強吸收，且530 nm處是花色苷的特征吸收，因此采用二極管陣列檢測器在紫外和可見光區(qū)進行同時檢測。實驗發(fā)現(xiàn)，流動相組成對分離效果影響很大。以甲醇-H3PO4為流動相時基線不穩(wěn)且分離效果不佳；以乙腈-H3PO4為流動相時，在2.2節(jié)條件下可以得到良好的分離效果。 圖1 紫甘薯花色苷提取物HPLC圖譜

Fig．1 HPLC chromatogram of extract from purple sweet potato

檢測波長（Detection wavelength）: a. 530 nm; b. 280 nm\\.

考慮到某些可能存在的雜質(zhì)在280 nm波長處無明顯吸收，而一般物質(zhì)都會有較大末端吸收，綜合考慮截止波長等因素，本實驗以210， 280和530 nm為輸出波長，檢驗所得目標(biāo)組分的純度。

3.2 HSCCC上樣原料的制備

實驗考察了不同溶劑對紫甘薯花色苷提取效果。結(jié)果表明， 60% 乙醇（以HCl調(diào)至 pH 3）提取時效果最好。提取液中含有多種花色苷類化合物，其中組分1和2 含量相對較高，提取液中還含有多種其它化學(xué)成分（圖1）。實驗發(fā)現(xiàn)，

直接以該粗提取物為HSCCC進樣原料時，雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，且易形成樣品栓，達不到理想的分離效果及效率。萃取和樹脂吸附是天然產(chǎn)物純化時常用的技術(shù)手段。實驗表明，乙酸乙酯萃取及HP2MGL大孔吸附樹脂純化可分別除去粗提物中大量的親脂性和親水性雜質(zhì)，純化后組分1和2 均得到較大程度富集。

3.3 HSCCC溶劑體系的選擇及分離效果

溶劑體系的選擇對分離效果至關(guān)重要。實驗通過HPLC（280 nm）測定分配系數(shù)K值選擇溶劑體系，不同溶劑體系的K值見表1。

實驗考察了多種溶劑體系的HSCCC分離效果，結(jié)果表明，在溶劑體系1和2中，由于K值較接近，兩組分完全不能分離；溶劑體系3對兩目標(biāo)組分有較好的分離，但各組分中均含有雜質(zhì)；溶劑體系4不能將兩組分分離，但能使兩組分與雜質(zhì)分離。本實驗對樣品進行兩次分離：第一次采用溶劑體系4進行分離，固定相保留率為40%（圖2）。收集270～315 min流出液，得到兩組分的混合物（圖3）；第二次用溶劑體系3對兩組分混合物進行分離，固定相保留率為70%（圖4），得到純度分別為98.7%和96.8%的組分1和2（圖5）。從實驗所用原料中共獲得63 mg組分1和48 mg組分2。

3.4 結(jié)構(gòu)鑒定

組分1：UV-VIS λmax（0.01% HCI-MeOH，nm）：526（加入AICI3無紅移）， 328， 295， 277; A440/A526＝12.9%；A330/A526＝61.7%；LC-HESI-UV-VIS：由于花色苷的1號位氧原子易帶上一個正電荷形成黃烊鹽離子，m/z 1069.27為分子離子峰［M］＋，即該組分的分子量為1069；MS2m/z 907.21 ［M－162（Glc）］＋；MS3 m/z 463.17［M－606（Phb＋Caf＋2Glc）］＋，m/z 301.09［Pn］＋； MS4m/z 286.02［Pn-CH3］＋（Pn為芍藥素苷元）；NMR：1H-NMR及1C-NMR數(shù)據(jù)見表2。UV-VIS、MS和1H-NMR的實驗數(shù)據(jù)均與文獻［9］相符，確證組分1的結(jié)構(gòu)為3-O-{6-O-（E）-咖啡酰-2-O-［6-O-（E）-對羥基苯甲酰-β-D-吡喃葡糖基］-β-D-吡喃葡糖苷}-［5-O-（β-D-吡喃葡糖苷）］芍藥素，結(jié)構(gòu)式見圖6。

組分2：UV-VIS λmax（0.01% HCI-MeOH，nm）: 529（加入AICI3無紅移）， 328， 295， 283；A440/A529＝145%；A330/A529＝98.3%；LC-HESI-MS：m/z 1125.24 為分子離子峰［M］＋，即該組分的分子量為1125； MS2m/z 96322 ［M－162（-Glc）］＋， MS3m/z 463.12［M－606（-Caf-Fer-2Glc）］＋，m/z 301.11［Pn］＋， MS4m/z 28606［Pn-CH3］＋；NMR， 1H-NMR及1C-NMR數(shù)據(jù)見表2。UV-VIS光譜、MS、1H-NMR及1C-NMR均與文獻［8，9］相符，確證組分2結(jié)構(gòu)為3-O-{6-O-（E）-咖啡酰-2-O-［6-O-（E）-阿魏酰-β-D-吡喃葡糖基］-β-D-吡喃葡糖苷}-［5-O-（β-D-吡喃葡糖苷）］芍藥素，結(jié)構(gòu)式見圖6。

圖6 組分1和組分2的化學(xué)結(jié)構(gòu)

Fig．6 Chemical structure of compounds 1 and 2

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Preparative Isolation of Anthocyanins from Purple Sweet Potato by

High-speed Counter-current Chromatography

LU Ying1，2，3， LI Jia-Yin2， LUO Jin2， LI Mi-Lu1， LIU Zhong-Hua1，2，3

1（National research Center of Engineering Technology For Utilization of Functional

Ingredients From Botanicals， Changsha 410128）

2（Department of Botanical Resource Engineering，

College of Horticulture and Landscape， Hunan Agricultural University ， Changsha 410128）

3（Hunan Province Key Laboratory of Crop Germplasm Innovation and Utilization， Changsha 410128）

Abstract High-speed counter-current chromatography （HSCCC） was successfully applied to separate and purify anthocyanins from purple sweet potato. With a two-phase solvent system composed of n-butanol-ethylacetate-0.5% acetic acid （3∶1∶4， V/V）， the upper phase as stationary phase， the lower phase as mobile phase at a flow rate of 2.0 mL/min， and injection volume of 300 mg， a mixgure of two anthocyanins was received by undertaking HSCCC. Subsequently， a refining HSCCC was performed to separate and purify these two compounds， with a two-phase solvent system of 0.2% trifluoroacetic acid -n-butanol-methyl tertiary butyl ether-acetonitrile （6∶5∶2∶1， V/V）， the upper phase as stationary phase， the lower phase as mobile phase at a flow rate of 1.5 mL/min， and injection volume of 100 mg. the two compounds were obtained separately with purities of 98.5% and 96.7%， respectively. The chemical structures of the two isolated compounds were identified by UV-VIS、ESI-MS/MS and NMR. Compound 1 was identified as peonidin 3-O-{6-O-（E）-caffeyl-2-O-［6-O-（E） -p-hydroxybenzoy -β-D-glucopyranoside］- β-D-glucopyranoside} -［5-O -（β-D- glucopyranoside）］ and Compound 2 was identified as peonidin3-O-{6-O-（E）-caffeyl-2-O-［6-O-（E）-ferulyl-β-D- glucopyranoside］-β-D-glucopyranoside}-［5-O-（β-D- glucopyranoside）］. 63 mg of Compound 1 and 48 mg of Compound 2 were obtained from 450 g of purple sweet potato. In conclusion， counter-current chromatography was shown to be an efficient， stable and reliable technique for the isolation of anthocyanins from purple sweet potato.

Keywords Purple Sweet Potato， Anthocyanins， High-speed Counter-current Chromatography， Preparative Isolation

（Received 29 September 2010; accepted 13 January 2011）