超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定動(dòng)物飼料中3種巴比妥類違禁藥物

摘 要 建立了超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）快速檢測(cè)動(dòng)物飼料中違禁添加的巴比妥、苯巴比妥和異戊巴比妥3種藥物的分析方法。樣品經(jīng)甲醇振蕩提取，再用C18固相萃取柱凈化處理后，采用UPLC-Q-TOF-MS分析檢測(cè)。在電噴霧負(fù)離子模式和飛行時(shí)間模式下，以20 mDa為提取離子窗口，輸入各化合物的精確分子離子質(zhì)量數(shù)得到相應(yīng)的提取離子色譜圖，以該色譜峰面積進(jìn)行定量分析。通過(guò)碰撞誘導(dǎo)解離模式（CID）得到各化合物碎片離子的精確質(zhì)荷比，進(jìn)一步確證各化合物的結(jié)構(gòu)。各化合物的質(zhì)量精確度均小于5×10－6，3種化合物在0.05～2.0 mg/L 范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，線性系數(shù)均大于0.99。本方法的巴比妥、苯巴比妥和異戊巴比妥的定量限（LOQ）分別為0.25， 0.20和0.23 mg/kg。3個(gè)添加水平（LOQ， 2LOQ和4LOQ）的回收率為62%～85%； 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于10%。本方法可用于飼料中禁用的巴比妥藥物的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 液相色譜； 四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜； 飼料； 巴比妥

2010-10-26收稿；2011-01-05接受

本文系國(guó)家科技支撐計(jì)劃（No. 2009BADB9B02），質(zhì)檢公益性行業(yè)科研項(xiàng)目（No. 200910145），國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃（No. 2008IK167），北京市科技計(jì)劃（No. D08050200310803）資助

 E-mail: fengzhang@126.com; xgchu@163.com

1 引 言

巴比妥類藥物為巴比妥酸（丙二酰脲）的衍生物，屬于安眠鎮(zhèn)靜類藥物［1］。獸藥臨床用作鎮(zhèn)靜劑，可減少動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)消耗，有益于增重。巴比妥類藥物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)有抑制作用，易產(chǎn)生藥物積累，導(dǎo)致死亡。我國(guó)農(nóng)業(yè)部176號(hào)公告已經(jīng)禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用巴比妥類藥物。然而，仍有非法使用的報(bào)道［2］。因此，建立快速分析飼料中巴比妥類精神藥物的方法十分必要。

當(dāng)前，針對(duì)巴比妥類藥物的常用檢測(cè)方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）［3，4］和液相色譜-四極桿質(zhì)譜法（LC-MS）［5，6］等，這些方法的靈敏度高，選擇性和特異性好，但難以完全闡明化合物的結(jié)構(gòu)裂解信息，不夠準(zhǔn)確［7］。目前，四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Q-TOF)技術(shù)可依據(jù)所測(cè)得的化合物及碎片的精確質(zhì)量數(shù)對(duì)其進(jìn)行確證分析，準(zhǔn)確性較高［8］。目前，尚未有應(yīng)用Q-TOF分析巴比妥類藥物的文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究應(yīng)用固相萃取技術(shù)和超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，優(yōu)化了前處理方法和色譜質(zhì)譜條件，建立了動(dòng)物飼料中巴比妥、苯巴比妥和異戊巴比妥3種違禁添加精神藥物的定性與定量方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

ACQUIT Ultra Performance LCTM超高效液相色譜儀、Synapt Q/TOF四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Waters公司）； 固相萃取柱: C18 SPE柱(500 mg， 3 mL， Waters公司)；氮吹儀（Caliper Lifesciences 公司）。

甲酸(純度為99%， Acros Organics公司)； 乙腈(HPLC級(jí)， Fisher科技公司)； 巴比妥、苯巴比妥和異戊巴比妥的標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(Millipore公司)。

2.2 樣品前處理

稱取已充分粉碎的飼料樣品2 g， 置于50 mL 離心管中，加入10 mL 甲醇，振蕩提取30 min后，以10000 r/min離心5 min，過(guò)濾。準(zhǔn)確移取濾液5 mL 于試管中，40 ℃氮吹至干，加入磷酸鹽緩沖液（pH 5.0）5 mL，潤(rùn)洗， 待凈化。

C18 固相萃取柱依次用甲醇、水和磷酸鹽緩沖液各5 mL活化。將上述提取物轉(zhuǎn)移至固相萃取柱，以0.5 mL/min 流速過(guò)柱，用5 mL磷酸鹽緩沖液平衡，5 mL 2%甲醇水淋洗小柱，棄去淋洗液，并于負(fù)壓下抽干5 min。用5 mL 正己烷-乙酸乙酯（7∶3，V/V）洗脫，收集洗脫液，40 ℃氮吹至干，加入甲醇溶解殘?jiān)?，過(guò)0.22

SymbolmA@ m膜，上機(jī)測(cè)定。

2.3 色譜和質(zhì)譜條件

Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18色譜柱(100 mm ×1 mm i.d.， 1.7

SymbolmA@ m ) ；柱溫：30 ℃；樣品室溫度4 ℃；進(jìn)樣體積5

SymbolmA@ L。流動(dòng)相A為甲醇， 流動(dòng)相B為0.1% (V/V)甲酸溶液， 梯度洗脫：0～3.0 min，55%～70% A；3～3.5 min，70% A；3.5～4.0 min，70%～55% A。流速為0.20 mL/min。

電噴霧離子源（ESI）：負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：2.5 kV， 錐孔電壓：30 V; 萃取錐孔電壓：4 V， 脫溶劑氣溫度：350 ℃； 離子源溫度：100 ℃；脫溶劑氣流速：300 L/h；錐孔氣流速：20 L/h；采集質(zhì)量數(shù)范圍50～1000 amu。數(shù)據(jù)采集模式：棒狀（Centroid）； 掃描采集時(shí)間：1 s； TOF運(yùn)行模式：V 模式。 參比溶液：亮氨酸腦啡肽（LE）濃度：200

SymbolmA@ g/L；采集時(shí)間：1 s；采集間隔時(shí)間：10 s；掃描精確質(zhì)量數(shù)：554.2615（負(fù)離子模式）。

第6期張 峰等： 超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定動(dòng)物飼料中3種巴比妥類違禁藥物

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

巴比妥類藥物屬于弱酸性化合物，可采用氯仿［9］和乙腈［10］等作為提取劑。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了氯仿、乙腈和甲醇的提取效果。實(shí)驗(yàn)表明，3種提取劑對(duì)巴比妥類藥物的提取率無(wú)明顯差異，但甲醇的毒性最小，因此本方法中采用甲醇提取，氮吹干后，選擇 磷酸鹽緩沖液（pH 5）溶解上樣，保證目標(biāo)物呈中性狀態(tài)。

為了凈化試樣去除雜質(zhì)并獲得較高回收率，本實(shí)驗(yàn)比較了固相萃取柱C18柱和HLB柱。在上樣之前，固相萃取柱采用與上樣液相同pH值的磷酸鹽緩沖液活化。提取液上樣后，需再用磷酸鹽緩沖液平衡，以2%(V/V)甲醇溶液淋洗，去除極性雜質(zhì)，再采用乙酸乙酯-正己烷（7∶3，V/V）溶液洗脫目標(biāo)藥物。結(jié)果顯示，在此條件下，C18固相萃取柱洗脫得到的巴比妥類藥物的回收率較高，凈化雜質(zhì)能力較好。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

由于電噴霧質(zhì)譜的電離是在溶液狀態(tài)電離，因此流動(dòng)相的組成和添加劑除了影響分析物的保留時(shí)間和峰形外，還會(huì)影響分析物的離子化效率，從而影響到目標(biāo)化合物的檢測(cè)靈敏度。本實(shí)驗(yàn)分別采用甲醇-0.1%甲酸和乙腈-0.1%甲酸作為流動(dòng)相，考察不同流動(dòng)相組成對(duì)于分析物峰形及離子化效率的影響。以甲醇-0.1%甲酸作為流動(dòng)相時(shí)，3種巴比妥類藥物的響應(yīng)值是以乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)的2.67倍（巴比妥）、1.65 倍（異戊巴比妥）和 1.25 倍（苯巴比妥）。因此，本研究采用甲醇-0.1%甲酸作為流動(dòng)相。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

通過(guò) Mass Lynx 軟件中Elemental Composition分析，得到目標(biāo)分析物的元素組成分析和對(duì)應(yīng)理論精確分子量相匹配的質(zhì)量精確度。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)化合物的實(shí)測(cè)分子量與精確質(zhì)量數(shù)匹配，在質(zhì)量精確度絕對(duì)值小于5 ×10－6，均可對(duì)該化合物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析。表1為各化合物的實(shí)測(cè)分子量、理論分子量和質(zhì)量精確度，3種化合物的質(zhì)量精確度絕對(duì)值在1.1×10－6～3.9 ×10－6之間。

由于提取離子的窗口大小對(duì)方法的靈敏度有一定的影響，對(duì)比圖1中3個(gè)提取離子200， 20和2 mDa 窗口下巴比妥的提取離子色譜圖發(fā)現(xiàn)，在提取離子窗口為200 mDa時(shí)，提取出的色譜峰噪音較大，信噪比很低，色譜峰形較差；提取離子窗口為2 mDa時(shí)， 雖然噪音很小，但是色譜峰過(guò)窄，難以準(zhǔn)確

表1 各化合物的實(shí)測(cè)分子量\\，理論分子量和質(zhì)量精確度

Table 1 Retention times and accurate mass measurements of molecular ions of target compounds in standard solution

化合物Compound保留時(shí)間Retention time

(min)元素組成Elemental

composition實(shí)測(cè)分子量Experimental mass

(m/z)理論分子量

Theoreticalmass (m/z)誤差 Error（mDa）（×10－6）

巴比妥 Barbital1.40C8H12N2O3183.0772

183.07700.21.1

苯巴比妥 Phenobarbital2.22C12H12N2O3231.0761231.0760－0.9－3.9

異戊巴比妥 Amobarbital3.33C11H17N2O3225.1237225.1239－0.2－2.7

圖1 0.2 mg/L 巴比妥標(biāo)準(zhǔn)品溶液的總離子流圖及不同提取窗口下的提取離子色譜圖

（m/z 1830770）

Fig．1 Enhanced selectivity of UPLC-TOF analysis of TIC (a) corresponding to reconstructed ion

chromatogram of barbital (m/z 183.0770) in standard solution (0.2 mg/L) with varying mass windows

a. Barbital standard solution; b.2 mDa; c. 20 mDa; d. 200 mDa

定量分析；

提取離子窗口為20 mDa時(shí)，色譜峰形較好，噪音干擾較少，適合化合物定量分析。因此，本研究以20 mDa為本實(shí)驗(yàn)的最佳提取離子窗口。

通過(guò)輸入各分析物精確分子離子質(zhì)量數(shù)和提取離子窗口，得到3種巴比妥類化合物的提取離子色譜圖（見(jiàn)圖2）。通過(guò)離子色譜圖的峰面積y和分析物濃度x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量分析。

圖2 3種巴比妥類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖及各化合物的提取離子色譜圖

Fig．2 TIC of Barbital standard solution （1 mg/L）and extracted ion chromatogram of the molecular ion for each compound

a. 巴比妥混合淋洗液（Barbital standard solution）; b：異戊巴比妥（Amobarbital)； c：苯巴比妥(Phenobarbital)； d： 巴比妥(Barbital)。

為了進(jìn)一步對(duì)化合物進(jìn)行確證分析，在碰撞誘導(dǎo)解析電離模式下，通過(guò)分析單個(gè)目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品溶液，優(yōu)化碰撞電壓條件，得到各化合物分子離子和主要的碎片離子，元素組成分析和質(zhì)量精確度。根據(jù)碎片離子的元素組成，推斷目標(biāo)物的可能裂解路徑。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化碰撞能量，選擇離子豐度最大的碎片離子為該化合物裂解的主要碎片離子。表2為3種巴比妥類藥物的主要碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)、相應(yīng)元素組成和質(zhì)量精確度。由碎片離子的元素組成和對(duì)應(yīng)的分析物的分子式相比較，計(jì)算各分析物丟失的元素和相應(yīng)的精確質(zhì)量數(shù)。例如，在表1中，分析物巴比妥，［M－H］ 組成為C8H12N2O3，精確質(zhì)量數(shù)為183.0770，碎片離子元素組成為C7H10NO2，理論質(zhì)量數(shù)為140.0712，丟失元素組成為CHNO，質(zhì)量數(shù)為

43.0058，依次計(jì)算本實(shí)驗(yàn)其余兩種巴比妥類藥物，發(fā)現(xiàn)3種該類巴比妥類藥物丟失的元素組成均為CHNO，質(zhì)量數(shù)為43.0058。根據(jù)巴比妥藥物的分子式可知，巴比妥為丙二酰脲衍生物。在電噴霧負(fù)離子模式下，推測(cè)在此實(shí)驗(yàn)條件下，該類分子式結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了如下斷裂［11，12］：［M－H］－ →［M－H－HCO－］ ，裂解路徑如圖3所示。根據(jù)此裂解規(guī)律，可對(duì)實(shí)測(cè)目標(biāo)分析物進(jìn)行確證分析。

Fig．3 Fragmentation pathway of barbital

3.4 樣品基質(zhì)效應(yīng)的消除

為了最大限度消除基質(zhì)效應(yīng)干擾，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配法定量。以空白飼料樣品的提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液，可使標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液具有相同的離子化環(huán)境，從而消除基質(zhì)效應(yīng)。

3.5 線性關(guān)系和精密度

配制巴比妥類藥物的質(zhì)量濃度為0.05， 0.10， 0.20， 0.50， 1.0 和2.0 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以目標(biāo)組分的峰面積y對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99；3種巴比妥類藥物的質(zhì)量濃度在0.05～2.0 mg/L范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。以定量離子對(duì)3倍信噪比（S/N）的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的樣品濃度作為儀器分析方法的檢出限（LOD），以S/N＝10的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的樣品濃度作為定量限（LOQ），其線性方程、相關(guān)系數(shù)，檢出限（LOD）和定量限（LOQ）見(jiàn)表3。

3.6 回收率和精密度

在豬飼料、雞飼料和預(yù)混料樣品中分別添加不同水平的3種巴比妥標(biāo)準(zhǔn)溶液，按前述實(shí)驗(yàn)方法及條件進(jìn)行回收率測(cè)定，在3個(gè)添加水平(LOQ， 2LOQ和4LOQ)下，回收率為62%～85%; 重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，精密度和回收率測(cè)定見(jiàn)表4。

本研究采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)建立了動(dòng)物飼料中3種巴比妥類違禁藥物的分析方法。四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜結(jié)合了四極桿質(zhì)譜的簡(jiǎn)便和飛行時(shí)間質(zhì)譜的超高效率，可以對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的目標(biāo)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確篩查。雖然靈敏度低于四極桿質(zhì)譜，但是由于飛行時(shí)間質(zhì)譜的高分辨率，可以對(duì)復(fù)雜的飼料基質(zhì)中的巴比妥類化合物的進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析，并對(duì)目標(biāo)分析物結(jié)構(gòu)進(jìn)行碎裂和解析。本方法的精密度、線性關(guān)系和靈敏度滿足動(dòng)物飼料中違禁添加巴比妥類藥物分析的要求。

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Simultaneous Determination of Three Barbitals in Feeds by

Ultra-Performance Liquid Chromatography-Quadrupole-

Time-of-Flight Mass Spectrometry

ZHANG Feng1， DING Fei1，2， CHU Xiao-Gang1， LI Fan-Zhu2，

YONG Wei1， WANG Xiu-Juan1， L Quan-Fu1，3， XU Cheng-Bao1，4

1(Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Beijing 100123)

2(Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053)

3(Southwest University， Chongqing 400715) 4(Agriculture University of HeBei， Baoding 071001)

Abstract A method using ultra-performance liquid chromatography (UPLC) quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (Q-TOF-MS) was developed for screening and confirmation of 3 barbital drugs， barbital， phenobarbital， amobarbital， in feeds. After homogenization， the samples were extracted with methanol， and then the extracts were directly purified through C18 cartridge. Identification and detection were achieved in the negative electrospray ionization (ESI) mode using Q-TOF-MS. Accurate mass measurements were performed at a mass resolution of 10000 using continuous introduction of a lock mass with 20 mDa mass window. The potential of UPLC-Q-TOF MS for confirmatory analysis was shown by determining the accurate mass of all compounds and fragment ions upon collision-induced-dissociation (CID) at different energies. The extra mass measurements errors for all barbital drugs were found to be within 5×10－6. The calibration graphs were linear in the concentration range of 0.05－2.0 mg/L for three drugs. All calibration curves showed good linearity (r＞0.99). The recoveries for all compounds in feeds were 62%－85% at the fortified levels of LOQ， 2LOQ and 4LOQ， with the limits of quantification (LOQ) of 0.25， 0.20 and 0.23 mg/kg. The relative standard deviations (RSD) for all compounds are less than 10%.

Keywords Ultra-performance liquid chromatography; Quadrupole-time-of-flight mass spectrometry; Feeds; Barbital drugs

(Received 26 October 2010; accepted 15 January 2011)