固相萃取-高效液相色譜法測定人體尿液中鄰苯二甲酸酯及其代謝物

摘 要 建立了同時測定人體尿液中鄰苯二甲酸酯及其代謝物的分析方法。對洗脫劑種類、洗脫體積、洗脫流速等影響因素進行考察，確定了最佳洗脫劑及洗脫體積為2 mL乙腈、2 mL乙酸乙酯和1 mL乙醚-正己烷（1∶19，V/V），洗脫流速1 mL/min。在最優(yōu)化的固相萃取-液相色譜條件下測定5種鄰苯二甲酸酯及其5種相應(yīng)的單酯代謝物，線性范圍為20～10000

SymbolmA@ g/L，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；檢出限為3.8～7.0

SymbolmA@ g/L；加標回收率為72.2%～102.3%；相對標準偏差均小于8%。利用本方法對5名育齡女性的尿液進行分析，除了鄰苯二甲酸二甲酯和鄰苯二甲酸二乙酯外，其余8種物質(zhì)均在尿液中檢出。

關(guān)鍵詞 固相萃??；液相色譜；鄰苯二甲酸酯；代謝物；尿液

2010-09-29收稿；2011-03-18接受

本文系北京市教委科技發(fā)展計劃基金（No.KM200710005025）、北京工業(yè)大學(xué)青年科研基金（No.X1005211200801）資助項目

* E-mail: wangxiaoyi@bjut.edu.cn

1 引 言

鄰苯二甲酸酯（Phthalic acid esters， PAEs）是一類內(nèi)分泌干擾物，具有類雌激素作用和抗雄激素作用，可干擾機體內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致生殖發(fā)育系統(tǒng)異常，并且具有一定的肝臟毒性和致癌作用［1］。PAEs是塑料行業(yè)常用的增塑劑，在塑料中的含量可高達20%～30%，廣泛存在于各種塑料制品中，如兒童玩具、容器、醫(yī)療器具等。由于PAEs不以化學(xué)鍵形式與產(chǎn)品中的化學(xué)物質(zhì)結(jié)合，在適當?shù)臈l件下，可不斷地向周圍環(huán)境釋放，造成環(huán)境污染。大量的研究表明，在食品、飲用水、土壤、大氣等環(huán)境中均不同程度的存在PAEs污染［2～4］。PAEs可通過呼吸道、消化道和皮膚等途徑進入人體［5～7］，并在體內(nèi)發(fā)生代謝。在人體尿液、血液、乳汁、精液和羊水等體液中均檢測到一定濃度的PAEs及其代謝物［8～10］。PAEs代謝物的監(jiān)測數(shù)據(jù)已成為PAEs內(nèi)暴露評價的一個主要依據(jù)［11，12］。

目前，關(guān)于PAEs在體內(nèi)的代謝研究大多建立在動物模型基礎(chǔ)上［13，14］，對于PAEs在人體內(nèi)的代謝情況，一般通過測定代謝物在體液中的含量和存在形式進行推斷［15，16］。尿液與其它體液相比價廉易得、容易取樣，因此，被普遍用于代謝研究和內(nèi)暴露評價。自2000年以來，國外的研究主要集中在尿液中PAEs一級代謝物和二級代謝物的研究，Blount等［17］采用兩根HLB固相萃取柱對樣品進行富集、液相色譜方法測定尿液中的PAEs一級代謝物，Silva等［18］對該方法進行了一系列的改進后，實現(xiàn)了在線固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜方法測定尿液中的PAEs一級代謝物和二級代謝物。但是對尿液中PAEs原型及其代謝物的同時測定未見報道。

本研究采用一根固相萃取柱富集樣品，分級洗脫，利用液相色譜法對常見的5種PAEs及其一級代謝物進行分離分析，實現(xiàn)了尿液中PAEs及其一級代謝物的同時測定。人體尿液中PAEs及其代謝物的同時測定，能夠同時監(jiān)測到PAEs及其代謝物在尿液中的濃度分布，對深入研究PAEs的體內(nèi)代謝和準確評價PAEs體內(nèi)暴露具有重要意義。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

1200 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），配MWD紫外檢測器；十二管防交叉污染固相萃取裝置（美國Supelco公司）；OASIS HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL，美國Waters公司）；BS110S電子分析天平（0.1 mg， 美國Sartorius公司）。為降低所用玻璃器具的空白值，將器具在鉻酸洗液中浸泡3 h，自來水洗凈后，高純水淋洗、丙酮淋洗，在烘箱中以80 ℃烘烤2 h。帶刻度的玻璃容器用氣流烘干機吹干。

鄰苯二甲酸酯及其代謝物標準品：鄰苯二甲酸二甲酯（DMP，99.5%）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP，99.0%）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（BBzP，98.0%）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP，99.5%）、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP，99.4%）、鄰苯二甲酸單丁酯（MBP， 97.8%）均購自美國ChemService公司；鄰苯二甲酸單甲酯（MMP， 99.4%，美國Sigma公司）；鄰苯二甲酸單乙酯（MEP，99.5%）、鄰苯二甲酸單芐酯（MBzP，99.0%）、鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（MEHP，99.0%）均購自美國AccuStandard公司；甲醇、正己烷、乙酸乙酯（色譜純， 天津津科精細化工研究所）；甲酸、乙醚（分析純， 天津福晨化學(xué)試劑廠）；乙醚使用前重蒸。乙酸、H3PO4（85%）、NaH2PO4（分析純， 北京化工廠）；乙腈 （色譜純，美國Tedia公司）；β-葡萄糖苷酸酶（美國Sigma公司）；高純氮氣（99.9993%，北京氧氣廠）。水為 Mili-Q超純水系統(tǒng)（美國Milipore公司）純化的純凈水。

2.2 標準溶液的配制

準確稱取MMP， MEP， MBP， MBzP和MEHP各0.1 g，以甲醇溶解，配制成2.0 g/L的單酯代謝物標準儲備液。準確稱取DMP， DEP， DBP， BBzP和DEHP各0.1 g，以甲醇溶解，配制成1.0 g/L的PAEs標準儲備液。準確移取適量PAEs及其單酯代謝物標準儲備液，以甲醇稀釋，配制成100 mg/L的10種PAEs及其單酯代謝物混合標準儲備液。再用甲醇稀釋，配制成10，4.0，2.0，1.0，0.4，0.2，0.08 和0.02 mg/L的混合標準溶液，置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆??；旌蠘藴嗜芤号c標準品比較，發(fā)現(xiàn)有問題時必須立即更換。

第6期林興桃等： 固相萃取-高效液相色譜法測定人體尿液中鄰苯二甲酸酯及其代謝物

2.3 色譜條件

HypersilC6H5色譜柱（250 mm×4.6 mm×5

SymbolmA@ m，大連依利特公司）；柱溫25 ℃。流動相A為乙腈（含0.1%乙酸），流動相B為水（含0.1%乙酸）。梯度洗脫：0～4 min，25% A；4～10 min，50% A；10～17 min， 80% A; 17～20 min， 100% A。流速0.8 mL/min；紫外檢測波長228 nm；進樣量20

SymbolmA@ L。

2.4 樣品前處理

移取1 mL尿液放入玻璃試管中，加入25

SymbolmA@ L β-葡萄糖苷酸酶，搖勻、密封放入37℃的水浴中酶解120 min。依次用1 mL乙腈、1 mL水和1 mL 0.14 mol/L磷酸鹽緩沖液淋洗活化HLB小柱。取1 mL酶 圖1 PAEs及其代謝物的色譜圖

Fig．1 Chromatogram of phthalic acid esters （PAEs） and their metabolites

1. 鄰苯二甲酸單甲酯（Monomethyl phthalate， MMP）；2. 鄰苯二甲酸單乙酯（Monoethyl phthalate，MEP）；3.鄰苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate， DMP）；4. 鄰苯二甲酸單丁酯（Monobutyl phthalate， MBP）；5. 鄰苯二甲酸單芐酯（Monobenzyl phthalate， MBzP）；6. 鄰苯二甲酸二乙酯（Diethyl phthalate， DEP）；7. 鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（Monoethylhexyl phthalate， MEHP）；8. 鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate， DBP）；9. 鄰苯二甲酸丁基芐基酯（Butyl benzyl phthalate， BBzP）；10. 鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（Di（2-ethylhexyl） phthalate， DEHP）。 解的尿樣與1 mL磷酸鹽緩沖液混勻過HLB柱子，然后用2 mL 0.1 mol/L甲酸和1 mL水分別淋洗小柱，再用2 mL乙腈、2 mL乙酸乙酯、1 mL乙醚-正己烷（1∶19，V/V）分別對小柱進行洗脫。洗脫液用高純氮氣吹干，以乙腈定容至0.2 mL，保存待測。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜分離條件優(yōu)化

PAEs及其代謝物是涉及了從弱極性到強極性范圍的化合物，需要采用梯度洗脫改變流動相的極性才能使混合物得到較好分離?？疾炝思状?水和乙腈-水為流動相的分離效果，甲醇-水體系得到的色譜峰峰形較差，化合物無法完全分離；乙腈-水體系得到的色譜峰峰形尖銳。采用2.3節(jié)的色譜條件，得到如圖1所示的液相色譜圖，5種PAEs及其相應(yīng)的單酯代謝物在24 min內(nèi)得到較好的分離。

3.2 固相萃取條件優(yōu)化

3.2.1 洗脫劑的選擇 洗脫劑的強度是影響洗脫效果的重要因素。應(yīng)采用不同強度的洗脫劑進行分級洗脫PAEs及其代謝物?？疾炝艘译?、乙酸乙酯、甲醇-乙醚（1∶19，V/V）和乙醚-正己烷（1∶19，V/V）等不同極性洗脫劑組合對待測物的洗脫效果。由圖2可見， 圖2 洗脫劑對回收率的影響

Fig．2 Influence of eluent on recovery

：乙腈、乙酸乙酯；：乙腈、乙酸乙酯、甲醇-乙醚（1∶19，V/V）；：乙腈、乙酸乙酯、乙醚-正己烷（1∶19， V/V） 。

：Acetonitrile， ethyl acetate；：acetonitrile， ethyl acetate， methanol-ethyl ester （1∶19， V/V）；：acetonitrile， ethyl acetate， ethyl ester-n-hexane （1∶19， V/V）乙腈、乙酸乙酯和乙醚-正己烷（1∶19，V/V）分級洗脫效果最好，PAEs及其單酯代謝物的回收率均大于75%。其次是乙腈、乙酸乙酯和甲醇-乙醚（1∶19，V/V），而乙腈和乙酸乙酯分級洗脫效果最差。因此，選用乙腈、乙酸乙酯和乙醚-正己烷（1∶19，V/V）對待測物進行分級洗脫。

3.2.2 洗脫劑的體積 選定乙腈、乙酸乙酯、乙醚-正己烷（1∶19， V/V）為洗脫劑，這3種試劑分別以1、1和1 mL組合，1、2和2 mL組合，2、1和2 mL組合，2、2 和1 mL組合，考察這4種不同用量組合對 PAEs及其代謝物的洗脫效果。不同用量組合得到的回收率如圖3所示，隨著乙腈和乙酸乙酯體積的增加，DMP、DEP等中等極性物質(zhì)的回收率提高；增大乙醚-正己烷（1∶19，V/V）的體積數(shù)，并沒有明顯提高DEHP等弱極性物質(zhì)的回收率。從圖3可見，2 mL乙腈、2 mL乙酸乙酯和1 mL乙醚-正己烷（1∶19，V/V）對待測物的洗脫效率最高，除了DMP的回收率為75.9%外，其余9種物質(zhì)的回收率均大于80%。DMP的回收率較低，可能是DMP在酸性條件下不易被吸附，部分流出了HLB小柱。

圖3 不同體積的乙腈、乙酸乙酯和乙醚-正己烷（1∶19，V/V）對回收率的影響

Fig．3 Influence of different volume of acetonitrile， ethyl acetate and ethyl ester-n-hexane（1∶19，V/V）on recovery

：1 mL，1 mL，1 mL；：1 mL， 2 mL ，2 mL； ：2 mL， 1 mL ，2 mL； ： 2 mL， 2 mL， 1 mL.

3.2.3 洗脫速度的選擇 洗脫速度也是影響洗脫效果的因素之一。速度太慢，延長分析時間；速度太快，待測物與洗脫劑接觸時間太短， 圖4 洗脫流速對回收率的影響

Fig．4 Influence of elution velocity on recovery

：0.5 mL/min；：1.0 mL/min；：1.5 mL/min；：2.0 mL/min.洗脫不完全。考察了0.5，1.0，1.5和2.0 mL/min流速下待測物的回收率。如圖4所示，在1.0和15 mL/min流速下，大部分物質(zhì)洗脫效果差別不大。但對于DMP，在1.5 mL/min 的流速下回收率為63.9%，而在1.0 mL/min流速下，回收率提高到70.1%，因此選用1.0 mL/min 的流速能使所有物質(zhì)達到較好的洗脫效果。

3.2.4 清洗劑的選擇 尿液中雜質(zhì)較多，干擾比較嚴重。調(diào)節(jié)清洗劑的強度和體積，可以去除部分雜質(zhì)，盡可能多的保留待測物?？疾炝思状?水（1∶9，V/V）、甲酸和水等作為清洗劑去除雜質(zhì)的效果及對待測物回收率的影響，選用2 mL甲酸和1 mL水去除干擾物的效果較好，并且能使待測物保持較高的回收率。MMP，MEP，MBP，MBzP，MEHP，DMP，DEP，DBP，BBzP和DHEP 10種待測物，在選用2 mL甲酸和1 mL水作清洗劑時，其回收率分別為93.6%，97.6%，90.2%，99.8%，93.5%，70.1%，85.1%，999%，887%和90.4%；在選用甲醇-水（1∶9，V/V）作為清洗劑時，其回收率分別為81.2%，91.5%，86.6%，989%，87.8%，69.8%，81.2%，97.7%，84.4%和85.5%。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 方法線性范圍和檢出限 在最優(yōu)的實驗條件下，對系列濃度標準溶液進行測定，結(jié)果見表1。5種PAEs及其單酯代謝物在20～10000

SymbolmA@ g/L范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系。檢出限在3.8～7.0

SymbolmA@ g/L之間，可滿足實際樣品的測定。

3.3.2 方法的回收率和精密度

從同一尿液樣品中準確移取5份相同體積的尿液，分別加入100

SymbolmA@ g/L的5種PAEs及其單酯代謝物進行加標實驗，按2.4節(jié)所述的前處理方法進行回收率實驗。 如表1所示，5種PAEs及其單酯代謝物的加標回收率在72.2%～102.3%之間；相對標準偏差（RSD）小于80%，方法的回收率和重現(xiàn)性均較好。

3.4 實際樣品測定

利用建立的分析方法對5位年齡在20～25 歲女性的尿液進行PAEs及其代謝物的測定，其中DBP和DEHP在尿液中100%檢出；MBP和MBzP在4份尿液中檢出； MEP和MEHP在3份尿液中檢出；MMP和BBzP只在1份尿液中檢出，而DMP和DEP未檢出。PAEs的代謝物MMP，MEP，MBP，MBzP和MEHP的平均濃度分別為39.5，281.5，39.9，85.4和22.9

SymbolmA@ g/L，而DBP，BBzP和DEHP的平均濃度分別為47.8，30.7和126.8

SymbolmA@ g/L。

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Determination of Phthalic Acid Esters and Their Metabolites

in Human Urine by Solid Phase Extraction-High Performance

Liquid Chromatography

LIN Xing-Tao1， WANG Xiao-Yi1， XIA Ding-Guo2， WU Qiong1， ZHAO Jing-Qiang

（College of Environmental and Energy Engineering， Beijing University of Technology， Beijing 100124）

（College of Engineering， Peking University， Beijing 100871）

Abstract A solid phase extraction-high performance liquid chromatographic （SPE-HPLC） method was developed for the determination of phthalic acid esters and their metabolites in human urine. The conditions of pretreatment such as eluent， elution volume and elution velocity were optimized. The optimized conditions were 2 mL of acetonitrile， 2 mL of ethyl acetate and 1 mL of ethyl ester-n-hexane （1/19， V/V） at the flow rate of 1 mL/min. Under the optimized conditions， five phthalic acid esters and their monoesters were determined by reversed phase liquid chromatography. Good linear relationships were obtained in the range of 20 The recoveries were in the range of 72.2% to 102.3% and relative standard deviations were lower than 8%. The method was applied to analyze five human urines collected from five fertile women. Except for dimethyl phthalate and diethyl phthalate， the others were found in the urines.

Keywords Solid phase extraction; Liquid chromatography; Phthalic acid esters; Metabolites; Urine

（Received 29 September 2010; accepted 18 March 2011）