分子印跡固相萃取技術(shù)檢測江水、尿液及牛奶中雌激素殘留

摘 要 以β-雌二醇和炔雌醇的分子印跡聚合物為填料制備固相萃取小柱，選擇60%（V/V）甲醇-水溶液作為雌激素的淋洗液，甲醇-乙酸（9∶1， V/V）為洗脫液，洗脫兩次可徹底洗脫固相萃取小柱中目標(biāo)分子。以建立的萃取條件對上海黃浦江水、尿液、牛奶中雌激素進(jìn)行富集，結(jié)合高效液相色譜法，建立了基于分子印跡固相萃取技術(shù)檢測上述實(shí)際樣品中雌激素的新方法，檢出限低于0.1 mg/L，回收率高于80%。

關(guān)鍵詞 分子印跡聚合物； 固相萃取； 雌激素

2010-08-19收稿；2010-11-13接受本文系國家自然科學(xué)基金（No.20775007）、853計(jì)劃（No.2007AA10Z433）和環(huán)境物理與化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（No.KF2009-08）資助

 E-mail: m_zihui@yahoo.com

1 引 言

近年來，大量研究表明，環(huán)境中存在多種能模擬和干擾動(dòng)物及人類機(jī)體功能的人工合成雌激素，如β-雌二醇、炔雌醇及己烯雌酚。這些雌激素進(jìn)入人體后，與正常分泌的激素競爭，結(jié)合細(xì)胞中的激素受體，造成人體激素過剩，內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，影響人體性激素的正常工作，多種機(jī)能出現(xiàn)障礙。這些雌激素的殘留已引起國內(nèi)外高度重視［1～6］。由于其在環(huán)境中含量非常低，給檢測帶來了困難。固相萃?。⊿olid phase extraction， SPE）具有易收集、能處理小體積試樣、操作簡單、回收率高、富集倍數(shù)大、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，是目前常用的痕量物質(zhì)前處理方法之一，在環(huán)境、藥物、食品及生物分析等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［6～12］。但是， 傳統(tǒng)SPE法選擇性不強(qiáng)，用于復(fù)雜樣品分析物富集時(shí)，常發(fā)生共萃現(xiàn)象，干擾色譜分析。分子印跡聚合物（Molecularly-imprinted polymers， MIPs）對目標(biāo)分子及其結(jié)構(gòu)類似物有特異性吸附，且具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性，并耐酸堿，非常適合分離富集復(fù)雜樣品中痕量分析物。自1994年Sellergren首次報(bào)道了在SPE中使用MIPs材料以來，分子印跡固相萃取技術(shù)（Molecularly-imprinted solid phase extraction，MISPE）得到了廣泛應(yīng)用［14～19］。該技術(shù)集選擇性分離、富集及進(jìn)樣于一體，能夠更高效地從復(fù)雜樣品中分離富集目標(biāo)分子，清除基體干擾，從而降低檢出限，提高分析精度和準(zhǔn)確性。

本研究組曾報(bào)道了對雌激素有良好族分離效果的MIPs的制備及其在水質(zhì)凈化方面的應(yīng)用［20］。本研究以β-雌二醇和炔雌醇的MIPs作為固相萃取吸附劑，建立了MISPE的分離富集方法，并應(yīng)用于上海黃浦江水、尿液及牛奶樣品中痕量雌激素殘留的富集和除雜。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Elite P230 HPLC系統(tǒng)（大連依利特分析儀器有限公司），配UV230紫外-可見檢測器，P230Ⅱ高壓恒流泵；紫外交聯(lián)儀（寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠）；TS-8型轉(zhuǎn)移脫色搖床（海林市其林貝爾儀器制造公司）；Anke KA-1000離心沉淀器（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

β-雌二醇（β-Estradiol，E2）、炔雌醇（Ethinylestradiol，EE）、己烯雌酚（Diethylstilbestrol， DES）標(biāo)準(zhǔn)品購于Alfa Aesar公司；三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）、丙烯酰胺（MA）均為分析純（Aldrich公司）；偶氮二異丁腈（AIBN，分析純，上海試思赫維化工有限公司）；乙酸（分析純，北京化工廠）；甲醇（MeOH）和乙腈（MeCN）均為色譜純（山東禹王實(shí)業(yè)有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾去離子水。

2.2 色譜條件

Sinochrom ODS-BP色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5

SymbolmA@ m，大連依利特分析儀器有限公司）；流動(dòng)相為乙腈-水（55:45，V/V），流速：1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長 205 nm。

2.3 MIPs和非印跡聚合物（NIPs）制備

MIPs可參考文獻(xiàn)［20］，用紫外光聚法制備。準(zhǔn)確稱取0.136 g（0.5 mmol）β-雌二醇或0.148 g（0.5 mmol）炔雌醇做模板分子與0.2132 g（3 mmol）功能單體MA溶于40 mL乙腈中，放置24 h，向其中加入1.0152 g（3 mmol）交聯(lián)劑TRIM和0.0057 g（0.035 mmol）引發(fā)劑AIBN，不間斷通入氮?dú)? min后，在4 ℃紫外光（365 nm）下聚合15 h。將所制得的聚合物用離心過濾法收集，用30 mL甲醇-乙酸（3∶1，V/V）混合溶液洗滌至無模板分子。再用15 mL甲醇清洗5次，每次1 h，放入45 ℃恒溫干燥箱干燥備用。NIPs按照以上步驟在不加模板分子的情況下合成。

第6期薛 敏等： 分子印跡固相萃取技術(shù)檢測江水、尿液及牛奶中雌激素殘留

2.4 固相萃取柱制備

在3 mL聚丙烯固相萃取小柱（150 mm×9 mm）中均勻填入適量MIPs（或NIPs）粉末，在SPE柱底部和聚合物上方加孔徑20

SymbolmA@ m的聚乙烯篩板，得到填充均勻、柱壓降適中的固相萃取小柱，用2 mL甲醇-乙酸（9∶1，V/V）溶液清洗小柱，收集流出液進(jìn)行HPLC檢測。未檢測出雌激素，說明MIPs中的模板分子已被清洗干凈。然后用1 mL超純水過柱以活化小柱。固相萃取過程通過調(diào)節(jié)真空度控制樣品流過SPE柱的速度，洗脫液由高效液相色譜儀分析。

2.5 實(shí)際水樣品處理

2.5.1 江河水 實(shí)際水樣品未檢出雌激素，取100 mL抽濾兩次以除去其中的懸浮顆粒，取200 mg/L的β-雌二醇、炔雌醇和己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)溶液各500

SymbolmA@ L加入到100 mL容量瓶中，分別以青春河水、黃浦江水和浦港河水稀釋至刻度，配制成1 mg/L實(shí)際樣品溶液，并取適量溶液稀釋成0.2 mg/L的實(shí)際樣品溶液，置于冰箱（4 ℃）中備用。

2.5.2 尿樣 正常女性受試者尿液未檢出雌激素，取30 mL于離心管中，3000 r/min離心15 min，取上層清液，經(jīng)0.45

SymbolmA@ m濾膜過濾。取處理過的尿液10 mL加入到100 mL容量瓶中，取200 mg/L的β-雌二醇、炔雌醇和己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)溶液各500

SymbolmA@ L加入容量瓶中，加水稀釋至刻度，得到1 mg/L實(shí)際樣品溶液。另配制0.2 mg/L的待測尿樣，置于冰箱（4 ℃）中備用。

2.5.3 牛奶 取未檢出雌激素的牛奶50 mL于250 mL燒杯中，向其中加入含有200 mg/L β-雌二醇、炔雌醇和己烯雌酚的母液各1 mL，在不斷攪拌下加入150 mL乙腈至牛奶沉淀完全。靜置，取上清液，以3000 r/min離心15 min，取上清液，得到3種雌激素含量均為1 mg/L的牛奶加標(biāo)溶液。以同樣方法配制2.162 mg/L的牛奶加標(biāo)溶液，置于冰箱（4 ℃）中備用。

3 結(jié)果與討論

3.1 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

以配制好的分別含有β-雌二醇、炔雌醇和己烯雌酚200 mg/L的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，將其稀釋配制成40， 20， 10， 5， 2.5， 1.25和0.625 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以HPLC分別測定各濃度下3種雌激素的峰面積，以峰面積積分值（y）對雌激素濃度（x，mg/L）做線性回歸，得到線性方程，以3倍信噪比（S/N＝3）計(jì)算檢出限（表1）。

表1 3種雌激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

Table 1 Standard curve and detection limit of three kinds of estrogens

化合物Compound回歸方程Regression equation相關(guān)系數(shù)Correlation coefficient檢出限Limit of detrection（mg/L）

β-雌二醇 Estradiol， E2y＝113.51x－36.2250.99970.066

炔雌醇 Ethynylestradiol （EE）y＝118.31x－11.6480.99970.065

己烯雌酚 Diethylstilbestrol （DES）y＝131.11x－55.7230.99960.095

3.2 優(yōu)化淋洗和洗脫條件

本研究所合成的MIPs的性能參數(shù)可參考文獻(xiàn)［18］。以不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇-水溶液為雌激素的淋洗液。如表2所示，60%（V/V）甲醇-水溶液淋洗上樣后，MISPE柱吸附的3種雌激素均未被洗出，而NISPE柱吸附的部分目標(biāo)分子已被洗脫下來；采用55%（V/V）甲醇-水溶液時(shí)，MIPs/NIP柱吸附的雌激素分子均未被洗脫，說明該淋洗液洗脫能力偏小，不足以破壞雌激素與聚合物間的疏水作用；當(dāng)甲醇含量為65%（V/V）及更高時(shí)，MIPs/NIP柱上吸附的雌激素分子均有部分被洗脫下來，說明所選溶劑的洗脫能力過大。究其原因是NIP主要以非特異性吸附雌激素，MIPs是通過在聚合過程中添加模板分子，從而得到含有特異識(shí)別模板分子的結(jié)合位點(diǎn)的聚合物，對雌激素吸附力強(qiáng)，因而兩種SPE柱吸附的雌激素被淋洗的難易不同。本研究采用2 mL 60%（V/V）甲醇-水溶液作為分離和萃取實(shí)驗(yàn)的淋洗液。

以1 mL甲醇-乙酸（9∶1， V/V）為洗脫液，洗脫1次，色譜分析結(jié)果如圖1所示， 圖1 β-雌二醇SPE柱洗脫劑用量對比圖

Fig．1 Comparison of eluents with β-estradiol SPE column

1. 第一次洗脫后（After once elution）； 2. 第二次洗脫后（After twice elutions）\\.與雌激素的標(biāo)準(zhǔn)樣品對照可知，流出液中有3種雌激素，再用該洗脫液洗脫1次收集的流出液，未檢出3種雌激素。雖然甲醇對MIP的模板分子幾乎沒有洗脫能力，但加入少量乙酸即可使其洗脫能力顯著增強(qiáng)，這可能是乙酸削弱了模板分子與MIP間氫鍵作用的結(jié)果。研究表明，2 mL甲醇-乙酸（9∶1， V/V）洗脫液可以徹底洗脫目標(biāo)分子。

3.3 回收率及精密度

用上述建立的MISPE方法，選擇1.0和0.2 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液作為上樣液，分別進(jìn)樣2和5 mL，平行實(shí)驗(yàn)3次。收集2 mL甲醇-乙酸（9∶1）洗脫液淋洗后的流出液，用HPLC檢測，確定回收率和精密度。結(jié)果如表3所示。當(dāng)上樣液濃度為1.0 mg/L時(shí)，β-雌

二醇和炔雌醇的MISPE對3種雌激素均有很高的吸附性能，富集倍數(shù)為9.7～10.6，平均回收率大于97%；而NISPE的吸附性能相對較差，對3種雌激素混合物富集后，回收率僅為55.1%，58.6%和84.0%。上樣液濃度為0.2 mg/L時(shí)，β-雌二醇和炔雌醇的MISPE對3種雌激素具有很高的吸附性能，富集倍數(shù)為20～25，平均回收率大于81%；NIP的回收率則顯著低于MIPs。

3.4 實(shí)際樣品中雌激素檢測

3.4.1 黃浦江水的添加回收實(shí)驗(yàn)

選擇1.0和0.2 mg/L的黃浦江水添加液，平行實(shí)驗(yàn)3次，測定準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見圖2和表4。上樣液濃度為1.0 mg/L時(shí)，β-雌二醇和炔雌醇的MISPE對3種雌激素具有很好的吸附性能，富集倍數(shù)為8.8～9.4倍，平均回收率大于88%；而NISPE的吸附性能相對較差，對3種雌激素混合物富集后，回收率只有41.1%，53.8%和80.9%。上樣液濃度為0.2 mg/L時(shí)，β-雌二醇和炔雌醇MIPs對3種雌激素具有很高的吸附性能，富集倍數(shù)為15.7～23倍，平均回收率大于64%；而NIP的吸附性能相對較差。

3.4.2 尿液添加回收實(shí)驗(yàn)

尿液成分復(fù)雜，含有尿素、尿酸、肌酐、氨及多種無機(jī)鹽等物質(zhì)，直接用HPLC檢測的結(jié)果中存在大量干擾，經(jīng)過MISPE柱處理后，則可得到清晰、無干擾的譜圖（以β-雌二醇SPE柱為例，如圖3所示）。這是因?yàn)镸IPs具有特異性，其只對目標(biāo)分子具有吸附作用，而對其他干擾組分并不保留，直接隨流動(dòng)相流出，這使得MISPE在樣品污染物的去除方面有著明顯的優(yōu)勢。選擇1.0和0.2 mg/L的尿液添加液，平行實(shí)驗(yàn)3次，測定準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果如表5所示。

上樣液濃度為1.0 mg/L時(shí)，β-雌二醇和炔雌醇的MISPE 對3種雌激素具有很高的吸附性能，富集倍數(shù)為8.9～12.3倍，平均回收率大于88%；而NISPE的吸附性能相對較差，對3種雌激素混合物富集后，回收率僅為23.2%，38.3%和80.7%，主要是對己烯雌酚的吸附。上樣液濃度為0.2 mg/L時(shí)，β-雌二醇和炔雌醇MIPs對3種雌激素具有很高的吸附性能，富集倍數(shù)達(dá)20.3～25.4，平均回收率大于81%；而NISPE的吸附性能相對較差，回收率僅為27.2%，42.3%和82.7%。

3.4.3 牛奶添加回收實(shí)驗(yàn) 選擇含水量90%，雌激素濃度為0.2162 mg/L的牛奶提取液作為上樣液，平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，測定準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果如表6所示。β-雌二醇和炔雌醇的MISPE對3種雌激素具有很高的吸附性能，富集倍數(shù)為9.4～11.1倍，平均回收率大于82%；而NISPE的吸附性能相對較差，對3種雌激素混合物富集后，回收率僅為22.9%，52.1%和72.8%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，未經(jīng)MISPE富集、純化的加標(biāo)樣品由于復(fù)雜基質(zhì)的干擾，未能檢測到本身含有的目標(biāo)物質(zhì)雌激素；而經(jīng)過富集處理后的樣品，出現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的色譜峰，即可實(shí)現(xiàn)對雌激素的檢測。樣品經(jīng)過分子印跡固相萃取柱純化及富集后，可有效消除復(fù)雜基質(zhì)對雌激素檢測結(jié)果的干擾， 對雌激素的檢出

限低于0.1 mg/L， 回收率高于80%，顯著提高了現(xiàn)有HPLC方法對雌激素檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。

4 結(jié) 論

MISPE技術(shù)可從復(fù)雜樣品中選擇性地分離富集目標(biāo)化合物，本研究發(fā)展了以β-雌二醇、炔雌醇為模版的MISPE技術(shù)，通過富集加標(biāo)江水、尿液及牛奶等樣品雌激素類污染物的實(shí)驗(yàn)，建立了對該類環(huán)境和生物樣品中痕量雌激素殘留的富集和檢測方法，經(jīng)MISPE處理后，HPLC對雌激素的檢出限低于0.1 mg/L，回收率高于80%，本方法具有良好的應(yīng)用前景。

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Application of Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction for

Determination of Estrogens in River Water， Milk

and Urine Samples

XUE Min1， WANG An1， WANG Yu2， WANG Dan1， L Zhi1，

MENG Zi-Hui1， ZHANG Wei-Bing2

1（School of Chemical Environmental Engineering， Beijing Institute of Technology， Beijing 100081）

2（School of Chemistry Molecularly Engineering， East China University of Science Technology， Shanghai 200237）

Abstract This paper describes the synthesis and use of a molecularly imprinted polymers （MIPs） against estradiol （E2） and ethynylestradiol （EE） as sorbents for on-column solid phase extraction of E2， EE and Diethylstilbestrol （DES） from aqueous complex samples. Combined with HPLC analysis， the method for estrogen determination based on molecularly imprinted solid phase extraction technology was developed， with lower detection limit of 0.1mg/L， and recovery rate above 80%. The method has been successfully applied to the analysis of estrogens in spiked river water， urine and milk samples， with recoveries of 88%， 88% and 82% respectively.

Keywords Molecularly-imprinted polymers; Solid phase extraction; Estrogen

（Received 19 August 2010; accepted 13 November 2010）