單細胞微膠囊的制備與表征

摘 要 基于微流體數(shù)字化微噴射技術進行了單細胞微膠囊制備實驗，探究了單細胞微膠囊的制備條件和粒徑變化規(guī)律。結果顯示，當微噴嘴的內徑及液體的脈沖流動步長小于2倍的細胞最小粒徑時，可實現(xiàn)單細胞微膠囊的制備。單細胞微膠囊的平均粒徑隨著微噴嘴內徑的增大而線性增大，可通過改變微噴嘴內徑調節(jié)單細胞微膠囊的粒徑大小。以200

SymbolmA@ m微噴嘴制備豬卵單細胞微膠囊，平均粒徑203.5

SymbolmA@ m，標準偏差5.86

SymbolmA@ m，粒徑均勻。數(shù)字化微噴射技術可用于生化分析、生物工程領域單細胞微膠囊的制備。

關鍵詞 單細胞； 微膠囊； 數(shù)字化微噴射； 微噴嘴

2010-11-04收稿；2011-01-04接受

本文系國家自然科學基金（No.50975152）資助

* E-mail: liqingliqing999 @163.com

1 引 言

單細胞封入微小液滴或微膠囊，可使細胞的新陳代謝局限于微小環(huán)境空間，無需純化過程，細胞內的分子水平反應物及分泌物即可快速達到分析濃度，并可阻止周圍溶液的稀釋［1，2］，在微環(huán)境下實現(xiàn)單細胞的組分快速分析、單細胞高通量檢測、單細胞內分子反應過程動態(tài)檢測等方面有廣闊的應用前景［3］，有望用于神經遞質代謝產物濃度的變化檢測。目前，包封單細胞于微液滴或微膠囊主要基于微流控芯片的微液滴生成技術。He等［4］結合微流控芯片的液滴生成技術和光鑷細胞操作技術，將單細胞或亞細胞組織引入皮升級或飛升級液滴，進行了單細胞的溶膜，細胞成分和酶活性測量，但不適用于大量細胞的操作和處理。程偉等［5］采用微流控芯片操縱、傳輸及實時監(jiān)測單細胞量子釋放及信號分子分泌過程。高健等［6］采用微流控芯片進行了單細胞進樣與溶膜。Koster等［7］組合多個微流控芯片單元實現(xiàn)了單細胞的包囊、培養(yǎng)、操縱和分析，單個腫瘤細胞包入33 pL液滴，分泌物達到抗體檢測水平只需6 h。微流控芯片需要精密的微閥、微泵的制作和組裝以及幾十微米的微管道的加工，每片芯片僅適合少量特定的細胞和特定場合，通用性差，制造成本和使用成本高。

本研究組基于微流體數(shù)字化噴射技術，實現(xiàn)了飛升級液滴的均勻噴射［8］，十幾微米人體淋巴細胞的數(shù)字化輸送和噴射［9］，制備了粒徑均勻的幾十微米海藻酸鈉微膠囊［10］。在前期工作的基礎上，本研究制備了單核或單細胞微膠囊，考察了制備單細胞微膠囊的實驗條件，探討了單細胞微膠囊粒徑變化規(guī)律，以便有效地控制單細胞微膠囊的制備。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

微流體數(shù)字化噴射系統(tǒng)、拉針儀及磨針儀均為自制；TS100-F熒光倒置顯微鏡（Nikon公司）; XTL-1體式光學顯微鏡（江南光電公司）; 計算機圖像采集系統(tǒng)。

TC4鈦合金微球（粒徑65～80

SymbolmA@ m，清華大學提供）；硼硅酸鹽玻璃管（4.8 mm×3.0 mm），毛細管（1.6 mm×1.0 mm， 1.2 mm×0.8 mm， 北京正天易科貿公司）。海藻酸鈉（化學純，國藥集團化學試劑公司），配制為2%和1.5%（m/V）溶液；CaCl2（分析純，汕頭市隴西化工廠），配制為2%（m/V）溶液。

采用硼硅酸鹽玻璃管或毛細管在拉針儀、磨針儀上制備所需內徑的微噴嘴，裝入海藻酸鈉溶液，懸浮有細胞或金屬微球。以自制的電磁鐵為作動器的微流體脈沖驅動-控制系統(tǒng)提供脈沖慣性力，作用于微噴嘴，進行液滴脈沖噴射，細胞或金屬微球被液滴包裹噴射而出，落入2%（m/V）CaCl2溶液，海藻酸鈉微滴與CaCl2溶液交聯(lián)反應形成細胞或金屬微球微膠囊。噴射不同種類、不同大小的細胞，只需更換一只微噴嘴。

TC4鈦合金微球微膠囊制備實驗：TC4鈦合金微球均勻懸浮于2%（m/V）海藻酸鈉溶液，微噴嘴內徑di為 400， 120和100

SymbolmA@ m，驅動頻率為2 Hz，驅動電壓為9， 12和15 V，數(shù)字化脈沖噴射。

魚卵微膠囊的制備實驗：魚卵均勻懸浮于1.5%（m/V）海藻酸鈉溶液，微噴嘴內徑di為1350， 1300， 1250， 1200和1150

SymbolmA@ m，驅動頻率2 Hz，驅動電壓9 V，數(shù)字化脈沖噴射。

豬卵細胞微膠囊的制備：微噴嘴內徑200

SymbolmA@ m，其它實驗參數(shù)同魚卵微膠囊。

第6期李 清等： 單細胞微膠囊的制備與表征

3 結果與討論

3.1 單核微膠囊制備條件

圖1為TC4鈦合金微球微膠囊圖像，a為多核，b為單核和雙核。不同制備條件下TC4鈦合金微球膠囊中包囊金屬微球的數(shù)量見表1（不考慮空微囊）。僅當微噴嘴內徑di＝100

SymbolmA@ m，di/dcmin≈1.67＜2，驅動電壓小于15 V，制備的微膠囊只含有單顆金屬微球，全部為單核微膠囊。

這是由于此時金屬微球在噴嘴管壁的約束下呈單列排列脈沖流動，其脈沖流動步長在驅動電壓 12 V時為100

SymbolmA@ m，小于2倍最小粒徑， 圖1 TC4鈦合金微球海藻酸鈉微膠囊

Fig．1 Sodium alginate microcapsules of TC4 titanium alloy micro-spheres prepared by different micro-nozzles

◎ ○: Single-core microcapsules；◎: Dual-core or single-core microcapsules； △: Multi-core microcapsules. di： 微噴嘴內徑（Inner diameter of micro-nozzle）；dcmin：金屬微球最小粒徑（Minimum size of metal micro-spheres）。

最小粒徑所需的電壓。

3.2 單魚卵微膠囊制備、粒徑變化規(guī)律和控制

采用內徑為1350， 1250和1150

SymbolmA@ m的微噴嘴制備魚卵細胞微膠囊，僅在1350

SymbolmA@ m微噴嘴制備的魚卵細胞微膠囊中發(fā)現(xiàn)一顆雙魚卵細胞微膠囊。單魚卵微膠囊粒徑dcm隨魚卵細胞粒徑dc變化曲線如圖2。每種微噴嘴制備的單魚卵微膠囊最小粒徑略小于di；

當dc＜di時，dcm≈di，微膠囊基本包容了魚卵；當dc＞di時，dcm隨dc的增大而增大，原因是微噴嘴中擠壓變形的魚卵噴出后恢復原有的形態(tài)，其體積控制了微膠囊的體積。因此，制備單細胞微膠囊時，

圖3 單細胞微膠囊平均粒徑與微噴嘴內徑的關系

Fig．3 Relationship between micro nozzles and single-core microcapsules in size

欲取得均勻的粒徑，di≥dcmax；若欲減少單細胞微膠囊中冗余空間，di可以盡量接近dc。圖3為不同內徑微噴嘴制備的單魚卵微膠囊的算術平均粒徑變化曲線，擬合曲線顯示呈線性關系。因此，可以通過改變管徑調節(jié)平均粒徑大小。

3.3 微流體數(shù)字化噴射技術制備單細胞微膠囊的普適性

以200

SymbolmA@ m的微噴嘴（dcmax＜di＜2dcmin）制備豬卵微膠囊，按照上述單核微膠囊的制備條件和粒徑變化規(guī)律，應得到粒徑較均勻的單細胞微膠囊。圖4顯示，獲得的微膠囊全部為單細胞微膠囊，其粒徑隨豬卵細胞粒徑變化曲線如圖5所示。卵細胞微膠囊的粒徑包容了細胞粒徑的變化，平均粒徑為203.5

SymbolmA@ m，標準偏差為5.9

SymbolmA@ m，粒徑較為均勻，受細

圖4 豬卵單細胞微膠囊Fig．4 Single-cell microcapsules of porcine oocytes

圖5 單豬卵細胞微膠囊-相應卵細胞粒徑關系

Fig．5 Size relationship between porcine oocytes and single-core microcapsules

胞粒徑變化影響小。

因此，基于微流體數(shù)字化噴射技術的單細胞微膠囊制備條件和粒徑變化規(guī)律廣泛適用于一般細胞的單細胞微膠囊制備和粒徑預測與控制。已經實現(xiàn)十幾微米的淋巴細胞的數(shù)字化傳輸和噴射［9］，相應的單細胞微膠囊的制備待后續(xù)研究中實現(xiàn)。

References

1 He M Y， Sun C H，Chiu D T. Anal. Chem.， 2004， 76（5）: 1222～1227

2 Griffiths A D， Tawfik D S. Trends Biotechnol.， 2006， 24（9）: 395～402

3 Tawfik D S，Griffiths， A D. Nat. Biotechnol.， 1998， 16（7）: 652～656

4 He M Y， Edgar J S， Jeffries G D， Lorenz R M， Shelby J P， Chiu D T. Anal. Chem.， 2005， 77（6）: 1539～1544

5 CHENG Wei， HUANG Wei-Hua， PANG Dai-Wen， WANG Zong-Li， CHENG Jie-Ke（程 偉，黃衛(wèi)華，龐代文，王宗禮，程介克）. Chem. J. Chinese Universities （高等學?；瘜W學報）， 2003， 24（9）: 1585～1587

6 GAO Jian， YIN Xue-Feng， FANG Zhao-Lun， XIA Fang-Quan（高 健，殷學鋒，方肇倫，夏方詮）. Chem. J. Chinese Universities （高等學?；瘜W學報）， 2003， 24（9）:1582-1584

7 Koster S， Angile F E， Duan H， Agresti J J， Wintner A， Schmitz C， Rowat A C， Merten C A， Pisignano D， Griffiths A D. David. Lab Chip， 2008， 8: 1110～1115

8 ZHANG Wei-Yi， HOU Li-Ya（章維一， 侯麗雅）. Science Technology Review（科技導報），2005， 23（8）: 4～9

9 MU Li-Li， HOU Li-Ya， ZHANG Wei-Yi（穆莉莉，侯麗雅，章維一）. CIESC Journal（化工學報），2010， 61（4）: 949～954

10 ZHANG Xiao-Le，HOU Li-Ya， ZHANG Wei-Yi（張曉樂，侯麗雅，章維一）. CIESC Journal（化工學報），2007， 58（8）: 2133～2137

Preparation and Characterization of Single-cell Microcapsules

LI Qing*1，2， HOU Li-Ya 1， ZHANG Wei-Yi1

1（Institute of Micro System， Nanjing University of Science and Technology， Nanjing 210094）

2（School of Mechanical Engineering and Automatization， North University of China， Taiyuan 030051）

Abstract A series of experiments to prepare single-cell micro-capsules were implemented based on digital micro-injection of micro-fluidics， and also their preparation condition and size variation were explored. The results showed that when the inner diameter of micro-nozzles and the pulse step of jetted liquid is less than 2 times minimum size of cells， the preparation of single-cell micro-capsules can be accomplished. The resultant micro-capsules average size increases linearly with the inner diameter of micro-nozzles so can be controlled by changing the inner diameter of the nozzles. The single-cell microcapsules of porcine oocytes prepared by 200

SymbolmA@ m micro nozzle are uniform in size， whose average size is 203.5

SymbolmA@ m with standard deviation of 5.86

SymbolmA@ m. The digital micro-injection of micro-fluidics can be applied to preparing single-cell micro-capsules in the field of biochemical analysis and biological engineering.

Keywords Single-cell; Microcapsules; Digital micro-injection; Micro-nozzle

（Received 4 November 2010; accepted 4 January 2011）