大口徑毛細(xì)管氣相色譜法快速測(cè)定MRS肉湯培養(yǎng)基中水溶性膽固醇

摘 要 建立了MRS肉湯培養(yǎng)基中水溶性膽固醇的氣相色譜測(cè)定法。1 mL樣品（含水溶性膽固醇的MRS肉湯培養(yǎng)基）與5 mL 0.5 mol/L KOH-甲醇溶液混合，然后于60 ℃水浴皂化30 min。產(chǎn)物游離膽固醇經(jīng)5 mL甲苯萃取后，采用HP-5大口徑石英毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm i.d. ×1.5

SymbolmA@ m）進(jìn)行分離、FID檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)、外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。本方法分析一個(gè)樣品僅需45 min；在5～250 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；回收率為95.6%～98.0%；日內(nèi)與日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.6%和1.9%。本方法具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 大口徑毛細(xì)管； 氣相色譜； 水溶性膽固醇； MRS肉湯培養(yǎng)基

2010-08-03收稿；2011-01-17接受

本文系國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（No. 2007AAZ354）及國(guó)家科技支撐計(jì)劃“十一五”奶業(yè)重大專項(xiàng)（No. 2006BAD04A09）資助

* E-mail: lanweizhang@yahoo.com.cn

1 引 言

水溶性膽固醇是一類由人工合成的化學(xué)物質(zhì)，在自然界中并不存在。Proksch等［1］于1978年首次報(bào)道了以膽固醇、二元酸和聚乙二醇為原料合成水溶性膽固醇的工藝路線。水溶性膽固醇最初被用于質(zhì)控血清中的膽固醇源，后來其應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)展。在微生物學(xué)領(lǐng)域，水溶性膽固醇主要用于研究乳酸菌體外對(duì)培養(yǎng)基中膽固醇的脫除作用［2，3］。由于膽固醇本身不溶于水，因此在添加到培養(yǎng)基之前必須進(jìn)行乳化處理，以使其在水相中能穩(wěn)定存在。而水溶性膽固醇在水中則具有高達(dá)60 g/L的溶解度［4］，無需乳化便可直接添加到培養(yǎng)基中，因而被廣泛應(yīng)用。

為了模擬腸道環(huán)境，培養(yǎng)基中水溶性膽固醇的添加量通常為100 mg/L左右［5］。不同乳酸菌對(duì)培養(yǎng)基中水溶性膽固醇的脫除能力有很大差別。某些乳酸菌對(duì)培養(yǎng)基中水溶性膽固醇的脫除能力可高達(dá)80%［6］。這表明當(dāng)培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)基上清液中的水溶性膽固醇的濃度可降低至20 mg/L左右。硫酸-鄰苯二甲醛比色法是目前唯一能夠?qū)θ绱说秃磕懝檀歼M(jìn)行檢測(cè)的比色法，因而被廣泛應(yīng)用［3，7］。然而，該方法偶爾會(huì)出現(xiàn)原因不明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可重復(fù)的現(xiàn)象［8］。因此，有必要開發(fā)一種穩(wěn)定性更好的檢測(cè)方法。本研究對(duì)氣相色譜測(cè)定培養(yǎng)基中水溶性膽固醇的方法進(jìn)行了研究，獲得了較滿意的結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

7890A 型氣相色譜儀配FID檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）；HP-5型石英毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm i.d.×1.5

SymbolmA@ m，美國(guó)安捷倫公司）； 圖1 水溶性膽固醇的分子結(jié)構(gòu)

Fig.1 Molecular structure of water-soluble cholesterol DK-98-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.5%）、水溶性膽固醇（純度20%（以游離膽固醇計(jì)），分子結(jié)構(gòu)見圖1）及牛膽鹽（牛膽汁凍干粉）購自美國(guó)Sigma化學(xué)品公司；MRS 肉湯（de Man-rogosa-sharpe）培養(yǎng)基購自英國(guó)Oxoid公司， MRS肉湯培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨10 g/L，牛肉粉 8 g/L，酵母浸粉 4 g/L，葡萄糖20 g/L，K2HPO4 2 g/L，三水醋酸鈉 5 g/L，檸檬酸三銨 2 g/L，七水硫酸鎂 0.2 g/L，四水硫酸錳 0.05 g/L，吐溫80 1 mL/L。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 含水溶性膽固醇的MRS肉湯培養(yǎng)基的制備 參照文獻(xiàn)［5］的方法配制。將水溶性膽固醇原始樣品用蒸餾水稀釋至10 g/L，然后將該稀釋液以1%（V/V）的添加量加至含0.3%（m/V） 牛膽鹽的MRS肉湯培養(yǎng)基中，漩渦混勻，即制備成含100 mg/L水溶性膽固醇的MRS肉湯培養(yǎng)基。

2.2.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化 采用L16（45） 正交設(shè)計(jì)對(duì)前處理過程中的5個(gè)潛在的影響因素進(jìn)行優(yōu)化。正交設(shè)計(jì)的因素水平表如表1所示。

1 mol/L Methanolic KOH solution8060正己烷 Hexance10

1 mL樣品與 5 mL皂化溶液分別添加到玻璃螺口試管內(nèi)，漩渦混勻，然后依照正交表的條件進(jìn)行皂化。皂化結(jié)束后，用自來水將試管內(nèi)液體冷卻至室溫，然后加入適量萃取劑，漩渦混合60 s，3000×g離心5 min。吸取1 mL 上層有機(jī)相，用氮?dú)獯蹈?，? mL 正己烷將其重新溶解，然后進(jìn)行色譜分析。最終結(jié)果以每微升培養(yǎng)基中所含游離膽固醇的峰面積表示。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)一次。

2.2.3 色譜分析條件

氫氣作載氣，恒流12 mL/min；不分流進(jìn)樣模式，不分流時(shí)間 1 min，進(jìn)樣量1.0

SymbolmA@ L；檢測(cè)器為FID； 溫度 300 ℃； 空氣400 mL/min，氫氣40 mL/min；補(bǔ)充氣為氮?dú)猓魉?0 mL/min；程序升溫條件：起始溫度160 ℃，以40 ℃/min 升至280 ℃，并保持7 min；采用峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

在目前色譜柱能夠耐受的溫度范圍內(nèi)， 水溶性膽固醇無法氣化，并且水溶性膽固醇的分子量也不恒定，因而無法直接采用氣相色譜法對(duì)其進(jìn)行定量分析。然而，水溶性膽固醇是一種酯化形式的膽固醇，其經(jīng)皂化處理后可轉(zhuǎn)變成游離膽固醇，后者便可以直接利用氣相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。因此，皂化是影響水溶性膽固醇?xì)庀嗌V法測(cè)定的關(guān)鍵步驟。目前，常用的皂化試劑主要有KOH-甲醇溶液［9］和KOH-乙醇溶液［10］；皂化時(shí)間從15 min到60 min不等；皂化溫度在50～80 ℃變化。皂化完成后，產(chǎn)物游離膽固醇必須經(jīng)有機(jī)溶劑萃取后才能進(jìn)行氣相色譜分析。因此，培養(yǎng)基中水溶性膽固醇的皂化產(chǎn)物游離膽固醇的萃取同樣是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要步驟。常用的萃取劑主要有甲苯、乙醚、石油醚和正己烷等，而萃取劑與液相的比例通常低于2∶1。

通過正交實(shí)驗(yàn)對(duì)上述潛在影響樣品前處理的因素進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在所設(shè)定的水平范圍內(nèi)，5個(gè)因素均會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生顯著影響（P<0.05）；極差分析和方差分析的結(jié)果均顯示各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響順序?yàn)檩腿╊愋停驹砘噭╊愋停据腿w積＞皂化溫度＞皂化時(shí)間；最優(yōu)條件為：皂化溶液05 mol/L KOH-甲醇溶液、皂化溫度60 ℃、皂化時(shí)間30 min、萃取劑為5 mL甲苯。此外，樣品與皂化溶液的體積比也可能是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的潛在因素。本研究未將該因素納入正交設(shè)計(jì)，而是直接將其固定在1:5，這是因?yàn)槲墨I(xiàn)［11，12］顯示，將樣品和皂化溶液的體積比控制在1∶5可獲得最高的回收率。

3.2 色譜分離

采用上述正交實(shí)驗(yàn)確定的最優(yōu)條件對(duì)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品及樣品分別進(jìn)行了測(cè)定。從圖2可見，即使在不分流的情況下，膽固醇的峰形依然良好，無拖尾現(xiàn)象，而且分析速度較快，膽固醇的保留時(shí)間僅為7.6 min，并能和培養(yǎng)基中的其它可萃取成分達(dá)到有效分離。

膽固醇為高沸點(diǎn)有機(jī)物。在耐高溫毛細(xì)管柱未出現(xiàn)時(shí)，研究者通常將膽固醇進(jìn)行衍生處理，以降低其沸點(diǎn)，然后再進(jìn)行色譜分析［13］。本研究采用的HP-5石英毛細(xì)管柱可耐受300 ℃的高溫，這使得直接對(duì)膽固醇這種高沸點(diǎn)有機(jī)物進(jìn)行氣相色譜分析成為可能。通常采用內(nèi)徑為0.32 mm的常規(guī)毛細(xì)管柱對(duì)食品或生物樣品中的膽固醇進(jìn)行定量分析，本研究采用內(nèi)徑為0.53 mm的大口徑毛細(xì)管柱。大口徑毛細(xì)管柱和常規(guī)口徑毛細(xì)管柱相比，具有較高的柱容量。此特性可以不分流進(jìn)樣。而不分流進(jìn)樣則是提高氣相色譜法檢測(cè)靈敏度的最直接、也是最有效的措施。

a. 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品（Standard sample， cholesterol）； b. 樣品（含水溶性膽固醇的MRS肉湯培養(yǎng)基）（Sample （MRS broth containing water-soluble cholesterol）；1.溶劑 （Solvent）：甲苯（Toluene）； 2. 膽固醇（Cholesterol）。

3.3 線性范圍及檢出限

分別吸取濃度為1， 2.5， 5， 10， 25和50 mg/L的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照3.1節(jié)確定的最優(yōu)條件進(jìn)行前處理，然后進(jìn)行色譜分析。結(jié)果表明，在1～50 mg/L濃度范圍內(nèi)，膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣濃度（X）與其峰面積（Y）呈良好線性關(guān)系。其線性方程為 Y＝23.45X－4.64，相關(guān)系數(shù)R＝0.9998。將標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣濃度折算成樣品進(jìn)樣濃度，則在5～250 mg/L濃度范圍內(nèi)，膽固醇進(jìn)樣濃度（X）與其峰面積（Y）之間的線性關(guān)系為Y＝4.69X－4.64。

根據(jù)信噪比S/N＝3計(jì)算得膽固醇檢出限為0.12 mg/L。將膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度折算成樣品濃度，則樣品中水溶性膽固醇的檢出限為0.6 mg/L（以游離膽固醇計(jì)）。

3.4 方法的精密度及標(biāo)準(zhǔn)加入回收率

3.4.1 精密度 將2.2.1節(jié)制備的樣品用含0.3%（m/V）牛膽鹽的MRS肉湯培養(yǎng)基稀釋5倍，然后用該混合物進(jìn)行準(zhǔn)確度及精密度實(shí)驗(yàn)。取18份上述樣品，每天測(cè)定6份，連續(xù)測(cè)定3 d。基于方差分析求取日間標(biāo)準(zhǔn)偏差、日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差及總的標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，本方法具有較高的精密度。日內(nèi)與日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.6%和1.9%。

3.4.2 準(zhǔn)確加入的回收率 采用加樣回收法測(cè)定方法的準(zhǔn)確度。取12份上述樣品，分成4組，每組3份，分別向每組樣品中添加0， 20， 50和80 mg/L膽固醇，然后進(jìn)行色譜分析。樣品中膽固醇測(cè)量值為22.9 mg/L。膽固醇添加濃度為20， 50和80 mg/L的回收率（n＝3）分別為98.0%， 95.6%和96.2%。

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Rapid Determination of Water-Soluble Cholesterol in MRS Broth by

Wide-Bore Capillary Gas Chromatography

GUO Chun-Feng， ZHANG Lan-Wei， LI Jing-Yan， ZHANG Ying-Chun， YI Hua-Xi， DU Ming， HAN Xue

（School of Food Science and Engineering， Harbin Institute of Technology， Harbin 150090）

Abstract A method for water-soluble cholesterol quantification in de Man-Rogosa-Sharpe（MRS） broth based on capillary gas chromatography was developed. Samples （1 mL） were saponified in capped tubes with 5 mL methanolic KOH solution （0.5 mol/L） by heating for 30 min at 60 ℃. The product （cholesterol） was extracted with toluene， and directly analyzed by gas chromatography. The analysis was carried out using a wide-bore column HP-5 （30 m×0.53 mm i.d.×1.5

SymbolmA@ m）， FID detector and external standard method for quantification. With this method， a single sample could be analyzed in 45 min. The linearity was excellent for the concentration range of 5－250 mg/L. The recovery and overall relative standard deviation （RSD） were 95.6%－98.0% and 1.6%， respectively. This method is rapid， simple and accurate.

Keywords Wide-bore capillary; Gas chromatography; Water-soluble cholesterol; de Man-Rogosa-Sharpe（MRS） broth

（Received 3 August 2010; accepted 17 January 2011）