高速逆流色譜分離制備甜瓜蒂中葫蘆素類化合物

摘 要 采用高速逆流色譜法分離制備了甜瓜蒂中3種葫蘆素類化合物。以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1.2∶0.8∶0.8∶1.2，V/V）為兩相溶劑系統(tǒng)，上相為固定相，下相為流動相。在主機(jī)轉(zhuǎn)速 800 r/min、流動相流速2.0 mL/min、分離溫度25 ℃、檢測波長 254 nm條件下進(jìn)行分離，所得產(chǎn)物純度經(jīng)HPLC檢測，結(jié)構(gòu)經(jīng)MS、1H-NMR 和13C-NMR 鑒定。 4 h內(nèi)從200 mg 經(jīng)XAD-16大孔樹脂預(yù)處理的粗提物中一步分離制備得到33.5 mg葫蘆素B、21.7 mg葫蘆素E和14.9 mg葫蘆素Ⅰ，純度分別為99.1%、98.3%和97.5%，結(jié)構(gòu)經(jīng)鑒定與文獻(xiàn)相符。

關(guān)鍵詞 高速逆流色譜；甜瓜蒂；葫蘆素B；葫蘆素E；葫蘆素Ⅰ

2010-11-25收稿；2011-01-05接受本文系浙江省中藥現(xiàn)代化專項（No.20060356）和浙江省教育廳科研項目（No.Y201018938）資助

* E-mail: hzlicp@163.com

1 引 言

甜瓜蒂（Pedicellus Melo）為葫蘆科植物甜瓜（Cucumis melo）的干燥成熟果柄。具有涌吐痰食、除濕退黃的功效。甜瓜蒂中含有的葫蘆素（Cucurbitacins）類化合物具有抗腫瘤、保肝、抗炎、提高機(jī)體免疫力、改善腸胃等功能［1～3］。目前，市場上用于治療腫瘤疾病的葫蘆素片主要為葫蘆素B和E的混合物。根據(jù)中藥現(xiàn)代化的發(fā)展趨勢，將葫蘆素進(jìn)一步分離純化，對提高其療效和生物利用度以及增加靶向性都非常關(guān)鍵，有利于在抗腫瘤藥效發(fā)揮的同時降低葫蘆素類藥物的毒性［4］，并且有助于進(jìn)行以葫蘆素為指標(biāo)性成分的藥材及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制。

高速逆流色譜（High-speed counter current chromatography， HSCCC）是一種不需要任何固體支撐體或載體的液-液分配色譜技術(shù)［5］。具有樣品回收率高、分離能力強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣、儀器操作簡單、分離量大等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離制備［6～9］。本實驗采用XAD-16大孔樹脂從甜瓜蒂中制備得到粗提物，以高速逆流色譜分離純化粗提物，經(jīng)一步洗脫分離得到3 種葫蘆素類化合物，分別為葫蘆素B、葫蘆素E和葫蘆素Ⅰ，結(jié)構(gòu)見圖1。利用HSCCC快速分離多種葫蘆素類成分的研究尚未見報道。

圖1 甜瓜蒂中分離出的化合物結(jié)構(gòu)式

Fig．1 Chemical structure of compounds separated from Pedicellus melo

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

TBE-300A高速逆流色譜儀（深圳同田生化技術(shù)有限公司）; HX-1050型恒溫循環(huán)器（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）; UVD-200紫外檢測儀（北京市新技術(shù)應(yīng)用研究所）; TBP-50A恒壓恒流微量泵（上海同田生化技術(shù)有限公司）; BSZ-100型自動部分收集器（上海滬西分析儀器廠）; N2000色譜數(shù)據(jù)工作站（浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司）； 1200型高效液相色譜儀（美國Aglient 公司）；KQ-250DE 型醫(yī)用數(shù)控超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司）；PTHW型電熱套（河南愛博特科技發(fā)展有限公司）；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）。

甜瓜蒂（安徽省亳州市真源堂藥業(yè)有限公司），經(jīng)浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室鑒定符合《中國藥典》2010 年版一部規(guī)定; 正己烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇（分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）；乙腈（色譜純，德國默克公司）；水為二次蒸餾水。

2.2 甜瓜蒂粗提物的制備

將甜瓜蒂藥材適當(dāng)粉粹，稱取粗粉300 g，加入10倍體積的65%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，過濾，合并濾液減壓濃縮至無醇味。將浸膏水溶后過XAD-16大孔樹脂柱，靜止吸附1.0 h后，依次用30%， 50%和95%乙醇進(jìn)行洗脫。接收50%乙醇洗脫物，減壓濃縮至浸膏后真空干燥，得淺黃色粉末10.5 g，冷藏，備用。

第6期金再宿等： 高速逆流色譜分離制備甜瓜蒂中葫蘆素類化合物

2.3 兩相溶劑的選擇

本實驗采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水為兩相溶劑體系，按不同配比混合搖勻，靜置后各取上下相2.0 mL，加入放有約1 mg樣品的試管中，漩渦振蕩，待兩相分層且澄清后，分別取上下相1 mL，旋轉(zhuǎn)蒸干，各加入1.5 mL 甲醇溶解，分別各進(jìn)行HPLC 測定，計算其分配系數(shù)K。

2.4 高效液相色譜條件

Extend C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5

SymbolmA@ m，美國Aglient 公司）；流動相：乙腈-水（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：228 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10

SymbolmA@ L。

2.5 高速逆流色譜分離條件

在分液漏斗中配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水兩相溶劑系統(tǒng)，將其充分振搖后靜置，分取上相為固定相，下相為流動相，兩相分別超聲脫氣30 min。主機(jī)轉(zhuǎn)速為800 r/min，流動相流速2.0 mL/min，分離溫度25 ℃，檢測波長254 nm，進(jìn)樣量200 mg，以上下相各取5 mL，進(jìn)樣。

3 結(jié)果與討論

3.1 HSCCC體系的選擇結(jié)果

本實驗采取了正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系，考察了6種不同體系配比下葫蘆素B、葫蘆素E和葫蘆素Ⅰ的分配系數(shù)和分離因子，結(jié)果見表1。實驗表明，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1.2∶0.8∶0.8∶1.2，V/V）溶劑體系時，可得到最佳的分配系數(shù)和分離因子。本實驗選擇此體系分離樣品。

用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1.2∶0.8∶0.8∶1.2，V/V）體系分離甜瓜蒂粗提物，進(jìn)樣量200 mg，HSCCC分離情況見圖2。經(jīng)分離得到3個主要組分峰A、峰B和峰C，固定相保留率為59%，分離效果良好。

3.3 產(chǎn)物純度的測定

采用2.4項的HPLC方法檢測，甜瓜蒂粗提物的色譜圖見圖3。經(jīng)HSCCC分離所得3個峰的色譜圖見圖4。3個化合物的純度經(jīng)測定分別為峰A 99.1%， 峰B 98.3%和峰C 97.5%。去溶劑后干燥稱重，分別為33.5， 21.7和14.9 mg。 圖2 粗提物的高速逆流色譜圖Fig．2 High-speed counter-current chromatographic

（HSCCC） chromatogram of crude extract

4 結(jié) 論

本實驗利用高速逆流色譜法對甜瓜蒂粗提物進(jìn)行了分離純化。在 HSCCC 溶劑系統(tǒng)為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1.2∶0.8∶0.8∶1.2，V/V）時，可從甜瓜蒂粗提取物中一步分離制備得 3 種純度較高的葫蘆素類成分，分別為葫蘆素 B，葫蘆素 E和葫蘆素Ⅰ。高速逆流色譜法具有簡便、快速、節(jié)省溶劑等特點(diǎn)，對于有效分離甜瓜蒂中葫蘆素類化合物具有較好的應(yīng)用價值。

References

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Preparative Isolation and Purification of Cucurbitacins from Pedicellus

Melo by High-Speed Counter-corrent Chromatography

JIN Zai-Su1， TIAN Hong-Mei1， TANG Lan1， RAO Gui-Wei2， FANG Ying-Guo2， LI Cheng-Ping2

1（College of Pharmaceutical Sciences ， Zhejiang University of Technology， Hangzhou 310014）

2（College of Biology and Environment Engineering， Zhejiang Shuren University ， Hangzhou 310015）

Abstract A preparative high-speed counter-current chromatography （HSCCC） was used to isolate and separate cucurbitacins from Pedicellus Melo. A successful isolation and purification was achieved at the following conditions: the two-phase solvent system composed of n-hexane-ethyl acetate-methanol-water at a volume ratio of 1.2∶0.8∶0.8∶1.2 was selected and the lower phase of the system was used as the mobile phase at the flow rate of 2.0 mL/min， the isolation temperature and revolution speed were set at 25 ℃ and 800 r/min， respectively. In 4.0 h， the isolation produced a total of 33.5 mg cucurbitacin B， 21.7 mg cucurbitacin E， and 14.9 mg cucurbitacin I with purities of 99.1%， 983% and 97.5%， respectively， determined by high performance liquid chromatography from 200 mg crude extract after cleaning-up by XAD-16 macroporous resin， which was necessary for the excellent purification. The chemical structure identification was carried out by 1H- NMR and 13C-NMR.

Keywords High-speed counter-counter chromatography; Pedicellus melo; Cucurbitacin B; Cucurbitacin E; Cucurbitacin I

（Received 25 November 2010; accepted 5 January 2011）