基于二元混合自組裝包裹納米顆粒的微傳感器抗體固定方法

摘 要 采用二元混合自組裝膜修飾納米金顆粒，在經(jīng)自組裝單分子層修飾的金電極上陣列式排布，并通過共價鍵固定抗體形成生物敏感膜。采用原子力顯微鏡、掃描電鏡和阻抗譜分別對電極表面的修飾過程進行了表征。納米粒子在微電極表面均勻分布，沒有明顯的團聚， 并且可實現(xiàn)抗體有效固定?；跇藴驶パa金屬氧化物半導體（Complementary metal oxide semiconductor， CMOS）工藝和微加工技術(shù)，利用該抗體固定化方法，制備了糖化血紅蛋白免疫微傳感器，可同時檢測血液中的糖化血紅蛋白和血紅蛋白含量，其對糖化血紅蛋白和血紅蛋白的檢測范圍分別為14～170

SymbolmA@ g/L和167～570

SymbolmA@ g/L。

關(guān)鍵詞 納米金; 互補金屬氧化物半導體; 微加工; 糖化血紅蛋白; 集成芯片

2010-08-10收稿；2010-11-01接受

本文系國家973計劃項目 (No. 2009CB320300)和國家863計劃項目(No. 2006AA04Z366) 資助

 E-mail: shxia@mail.ie.ac.cn

1 引 言

目前，便攜式生物傳感器的研究已成為熱點，但很多免疫傳感器還是基于酶標或者抗原抗體標記等方法，繁瑣、耗時且造價較高［1，2］。一些研究者應用離子敏場效晶體管 （Ion sensitive field-effect transistor， ISFET），在較寬范圍內(nèi)實現(xiàn)快速免標記的免疫檢測。ISFET以基于標準互補金屬氧化物半導體（Complementary metal oxide semiconductor， CMOS）工藝制備，為生物傳感器微型化及批量生產(chǎn)提供了一種新思路?；贗SFET的微型免疫傳感器，可實現(xiàn)快速無標記檢測。

在免疫傳感器制備過程中，固定抗體是非常關(guān)鍵的步驟。隨著傳感器從厘米尺度減小到毫米尺度，免疫傳感器的敏感表面面積也變得很小，可以固定在敏感表面的生物分子量也隨之減少［3］。如何在微型傳感器敏感表面上高效固定生物分子，并且有效控制其表面特性，成為了微型免疫傳感器的研究難點。

納米粒子的引入對于增強表面信號是一個非常有益的手段［4］。納米粒子具有較高的比表面積，使得微型傳感器表面的生物分子固定量呈指數(shù)倍增長。自組裝單分子層與生物大分子以分子鍵結(jié)合，性能穩(wěn)定，生物相容性強并能抑制干擾信號。然而單一成分的自組裝分子層容易造成較大的空間位阻，阻礙生物大分子的固定效率。二元混合自組裝膜的二維空間結(jié)構(gòu)能夠降低電極表面固定化抗體的空間位阻，使抗體具有良好的空間分布，有助于抗體的固定，及保持抗體的免疫活性［5］。

本研究在納米金顆粒表面修飾包裹二元混合自組裝膜，再將修飾過的納米金顆粒固定到經(jīng)自組裝單層膜修飾的電極表面，共價鍵固定抗體形成生物敏感膜。本方法利用了納米顆粒比表面積大的特點，增加了抗體的固定量；同時，納米顆粒引入了特定的功能團，有利于生物分子的穩(wěn)定結(jié)合，并能減少非特異性的結(jié)合，降低噪聲干擾。此外，修飾的自組裝膜使納米顆粒在液相中均勻分散，將納米顆粒固化到電極表面后，也能保持均勻分散，有效抑制了納米顆粒的團聚。采用此抗體固定化方法制備了檢測糖化血紅蛋白的微傳感器。本微傳感器由采用標準CMOS工藝加工的場效應傳感集成芯片和采用微加工技術(shù)制備的柵電極試條組成［6，7］，可實現(xiàn)糖化血紅蛋白和血紅蛋白的同時檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Gamry Reference 600電化學分析儀 （美國Gamry公司）； S-4800掃描電鏡 （FE-SEM，日本Hitachi公司）； Nanoscope IV原子力顯微鏡 （美國Vecoo公司），輕敲工作模式。

糖化血紅蛋白抗體、血紅蛋白抗體（北京怡成生物技術(shù)有限公司）；糖化血紅蛋白質(zhì)控品（美國Fitzge-rald公司）；巰基乙胺，16-巰基十六酸 （HSC15H30CO2H））， 3-硫基丙酸 （HSCH2CH2CO2H）， 1，2-二氯乙烷（EDC）， N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）， 納米金溶膠 （8～12 nm in diameter）， 磷酸鹽緩沖液 （PBS， pH 7.4）均購自美國Sigma公司； SU8 2100膠（美國MicroChem公司）。其它試劑均為分析純，購自北京化學試劑公司。

2.2 免疫微傳感器制備

微型免疫傳感器包括ISFET集成芯片和一次性微型延長柵電極陣列（圖1）。微型延長柵電極陣列在柔性材料上由MEMS工藝制備，分為糖化血紅蛋白和血紅蛋白兩個通道，每個通道都有金敏感電極和金鈍化電極，兩個通道共用一個鉑參比電極。兩個金敏感電極分別固定糖化血紅蛋白抗體和血紅蛋白抗體，兩個金鈍化電極固定有惰性蛋白。 圖1 （a） 微型糖化血紅蛋白傳感器檢測原理圖; （b）， 微型延長柵電極陣列; （c）， 基于ISFET/REFT的CMOS集成芯片

Fig．1 （a）， Schematic graph of hemoglobin-A1c micro-sensor design; （b）， Photo of micro extended gate electrode array chip; （c）， Photo of integrated chip based on ion sensitive field-effect transistor/reference field-effect transistor（ISFET/REFET）

金電極的圓形敏感面及參比電極的有效部位由SU8膠形成的三維微結(jié)構(gòu)測量池所限定。測量池使得測試試劑用量僅為10

SymbolmA@ L。ISFET集成芯片基于CMOS標準工藝，集成兩組ISFET/參比場效晶體管（Reference field-effect transistor，REFET） 敏感器件和信號處理電路。ISFET和REFET分別與延長柵電極陣列的敏感電極和鈍化電極連接，電極表面的電荷變化影響場效晶體管（Field-effect transistor，F(xiàn)ET） 的閾值電壓，敏感電極和鈍化電極的響應以差分電壓的形式輸出。

2.3 生物分子固定化

2.3.1 自組裝單層膜修飾金電極 將電極浸泡于10 mmol/L巰基乙胺的乙醇溶液中12 h，巰基乙胺的巰基可以與金電極表面形成強烈的共價鍵，在金電極表面形成自組裝單層膜。

2.3.2 二元混合自組裝膜包裹納米金 在納米金溶膠溶液中加入10 mol/L 16-巰基十六酸， 3-硫基丙酸1∶1混合液，攪拌，過夜，反復離心清洗，溶于去離子水制成包裹有混合硫醇的納米狀顆粒懸液。

第6期薛茜男等： 基于二元混合自組裝包裹納米顆粒的微傳感器抗體固定方法

2.3.3 納米金的固定 將2.3

SymbolmA@ L EDC與50

SymbolmA@ L 10 g/L NHS振蕩混合均勻后，加入8 mL納米球狀顆粒懸液中，攪拌15 min，活化納米金表面的羧基。將組裝有巰基乙胺的金電極清洗吹干后，在納米球狀顆粒懸液中浸泡2 h?；罨聂然c巰基乙胺的氨基結(jié)合，包裹有混合硫醇的納米球狀顆粒組裝到金電極表面，形成納米顆粒陣列。

2.3.4 生物分子固定 在4個金電極敏感表面各滴加EDC-NHS混合溶液0.5

SymbolmA@ L。靜置15 min后，在兩個敏感電極表面分別滴加1.3 g/L糖化血紅蛋白抗體、10 g/L血紅蛋白抗體；在另兩個鈍化電極表面滴加10 g/L牛血清蛋白。于4 ℃密閉濕潤的環(huán)境下靜置3 h。通過EDC和NHS表面活性劑的活化，電極表面的羧基形成活性基團與抗體或惰性蛋白表面的氨基穩(wěn)定結(jié)合，使得生物大分子穩(wěn)定固定于微型電極表面。最后在每個金電極的敏感表面滴加10 g/L牛血清蛋白，于4 ℃密閉濕潤的環(huán)境下靜置1 h，以封閉電極表面剩余的活性位點，防止測試溶液中其它蛋白的非特異性吸附給測試結(jié)果帶來的偏差。以抗體的固定為例，金電極敏感表面的修飾過程見圖2。

圖2 微型金電極表面修飾過程

Fig．2 Scheme of antibody immobilization progress

3 結(jié)果與討論

3.1 掃描電鏡（SEM）表征表面形貌

采用SEM觀測微型電極表面形貌。從圖3可見，金電極表面修飾納米顆粒并固定抗體后，可明顯看到納米顆粒。文獻［8］報道，納米金顆粒通常易在電極表面團聚，且不容易分散均勻。SEM觀測結(jié)果表明，此種抗體固定化方法應用于微型電極修飾，可將納米顆粒均勻分布，顆粒尺寸相對一致，約為10～20 nm，未觀察到明顯的團聚現(xiàn)象，有利于抗體的固定。

3.2 原子力顯微鏡（AFM）表征抗體固定過程

AFM的輕敲模式是常用的表面分析方法，對固定化生物膜表面形貌及密度的分析尤其重要，近年來，用AFM輕敲模式法對固定化生物膜表面分子的尺寸分析報導［9］逐漸增多。AFM進行表面分子尺寸分析時，粒子的高度反映了真實值［10］，而粒子在水平方向的寬度與針尖放大效應有關(guān)。圖4a為金電極表面組裝有自組裝單分子層的AFM圖， Z軸方向平均高度Rz約為1.814 nm；在修飾過混合自組裝膜包裹的納米顆粒后，均勻、連續(xù)地分布著顆粒狀納米結(jié)構(gòu)（圖4b），Rz約為5.393 nm。緊密堆積的表面粒子在Z方向上高度可近似認為緊密堆積的粒子的半徑，其尺度與SEM表征表面形貌尺寸吻合，證明本方法可將納米顆粒成功修飾于電極表面，呈連續(xù)密閉分布，且分散均勻。

圖3 抗體-納米顆粒陣列-金微型電極表面SEM圖

Fig．3 Scanning electron microscopy （SEM） images of antibodies-nano particles-SAM-Au surface

圖4 原子力顯微鏡（AFM）表征抗體固定過程：（a） 自組裝分子層修飾金電極; （b）修飾有納米顆粒陣列的金電極表面

Fig．4 Atomic force microscopy （AFM） characterize the process of antibody immobilization: （a） SAM-Au; （b） nano particles-SAM-Au

圖5 阻抗譜檢測微型電極表面圖譜：（a）， 自組裝分子層修飾金電極；（b）， 修飾有納米顆粒陣列的金電極表面；（c）， 抗體固定后的金電極表面

Fig．5 Electrochemical impedance spectroscopy: （a）， SAM-Au; （b）， nano particles-SAM-Au; （c）， antibodies- nano particles-SAM-Au.

3.3 阻抗譜表征抗體固定過程

采用電化學交流阻抗譜對電極表面的修飾過程進行表征，其中交流阻抗譜圖曲線半圓的直徑為電子傳遞的阻抗Ret。圖5顯示了不同修飾電極在含有5 mol/L K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］ 的PBS溶液中的交流阻抗譜圖，其半圓越小，電子傳遞效果越強。如圖5B所示，裸金電極的阻抗譜（曲線a）近似呈直線，顯示出較好的導電性。在其表面組裝有納米顆粒陣列后（曲線b），表面阻抗Ret增大。這是因為納米金顆粒包裹有絕緣性的自組裝膜?？贵w固定在微傳感器表面后（曲線c），表面阻抗Ret又略有降低。這是因為糖化血紅蛋白抗體在測試溶液中攜帶有一定電荷量。此結(jié)果表明，電極表面的修飾達到了預期的結(jié)果，抗體成功固定在微型電極的表面。

3.4 微型傳感器濃度響應曲線

糖化血紅蛋白水平是檢測糖尿病的重要指標，以糖化血紅蛋白 （Hemoglobin-A1c， HbA1c） 占總血紅蛋白 （Hemoglobin） 含量的百分比表示，被美國糖尿病協(xié)會列為糖尿病檢測的金指標［11］?？疾靷鞲衅鲗Σ煌瑵舛忍腔t蛋白傳感器的響應電位，測試在稀釋的糖化血紅蛋白質(zhì)控品中進行。其中含有糖化血紅單白、血紅蛋白、牛血清蛋白、PO3－4、Na＋等物質(zhì)。結(jié)果表明，隨著糖化血紅蛋白濃度的增加，傳感器的響應電位相對空白溶液的變化量成比例變化。如圖6所示，糖化血紅蛋白的線性范圍為13.75～170.5

SymbolmA@ g/L， 相關(guān)系數(shù)為0972，響應靈敏度為17.4 mV/（logCHbA1c）。正常人體中血紅蛋白濃度約為110～160 g/L，糖化血紅蛋白與血紅蛋白比大于7%，即診斷為糖尿病，最高為15%。為了適應人體糖化血紅蛋白水平，并基于微傳感器對糖化血紅蛋白檢測范圍，測試其對167～570

SymbolmA@ g/L血紅蛋白的響應，其響應靈敏度為300 mV/（logCHb），相關(guān)系數(shù)為0.953。此微型傳感器性能滿足臨床測試需求，并且響應不受雜質(zhì)離子的影響，可以實現(xiàn)對糖化血紅蛋白和血紅蛋白的同時檢測。 圖6 微傳感器對糖化血紅蛋白（HbA1c）及血紅蛋白（Hb）濃度響應曲線

Fig．6 Response of immunosensor to concentration of HbA1 c

為考察傳感器的臨床應用前景，對糖化血紅蛋白水平為8.4%的實際血樣進行了測試。通常血樣進行測試時需先加入細胞裂解液，裂解紅細胞內(nèi)的血紅蛋白/糖化血紅蛋白。為適應微型傳感器的檢測范圍，先將實際血樣用裂解液稀釋10倍，再依次用PBS配制0.1%牛血清蛋白溶液和去離子水，將其稀釋30000倍后進行測試。3片微傳感器對同一血樣測試結(jié)果為8.51%， 8.69%和8.43%； RSD為1.56%； 回收率為97.03%±2.74%。

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Micro Biosensor Antibody Immobilization Method Based on Mixed

Self-assembly-monolayers Wrapped Nano-particle

XUE Qian-Nan1，2， BIAN Chao1， TONG Jian-Hua1， SUN Ji-Zhou1， ZHANG Hong1， XIA Shan-Hong１

1（State Key Laboratory of Transducer Technology Institute of Electronics，

Chinese Academy of Sciences， Beijing 100190）

2 （Graduate University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100080）

Abstract Nano-gold particles that wrapped by mixed self-assembly monolayers （SAM） were immobilized on the SAM-modified Au micro electrode surface by amide linkage to form nano-particles array. Subsequently， a sensitive bio-film on the micro immunosensor surface was formed with covalent immobilization of antibodies on the nano-particles. Micro electrode surface modification process was characterized by atomic force microscopy， scanning electron microscope， and electrochemical impe-dance spectroscopy. The results indicated that the nano-particles distributed uniformly without appa-rent aggregation and the antibodies can be effectively immobilized on the microelectrode surface. Using this antibody immobilization method， hemoglobin-A1c （HbAIc） micro-sensors were prepared. Based on complementary metal-oxide-semiconductor （CMOS） standard process and micro-electronic-mechanical system （MEMS） technology， the immunosensor can detect hemoglobin-A1c and hemoglobin simultaneously with the range of 166.7－570

SymbolmA@ g/L hemoglobin and 13.75－170.5

SymbolmA@ g/L HbA1c.

Keywords Nano-gold; Metal-oxide semiconductor; Micro-electronic mechanical system; Hemoglobin-A1c; Integrated chip

（Received 10 August 2010; accepted 1 November 2010）