超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定草魚肉中阿苯達唑及其代謝物殘留

摘 要 建立了同時測定草魚肉中阿苯達唑及其3種代謝物阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）分析方法。草魚肉樣品通過堿性乙酸乙酯提取，正己烷凈化，超高效液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜檢測，氘代同位素內(nèi)標定量。本方法分析時間短，在4 min內(nèi)即可完成4種被分析物的液質(zhì)聯(lián)用分析。本方法在0.1～10

SymbolmA@ g/kg范圍內(nèi)各物質(zhì)線性良好，線性系數(shù)在0.9991～0.9996之間。阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜在0.5～5.0

SymbolmA@ g/kg添加水平下的平均回收率分別為98.4%～102.6%， 97.1%～103.4%， 98.8%～103.7%和101.1%～104.2%檢出限分別為0.2， 0.1， 0.2 和0.1

SymbolmA@ g/kg；日內(nèi)精密度小于4.77%，日間精密度小于3.03%。本方法為阿苯達唑及其代謝物的檢測及監(jiān)控提供了一種快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好的定量分析方法。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜； 阿苯達唑； 草魚

2010-10-11收稿；2011-01-24接受

本文系浙江省水產(chǎn)加工產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目（No.2011R09031-15）和浙江省重大科技專項項目（No.2008C02013）資助

 E-mail:xiaojun3627@163.com

1 引 言

阿苯達唑是一種苯并咪唑類藥物，其化學名稱為5-丙硫基苯異咪唑-2-氨基甲酸甲酯。阿苯達唑在國內(nèi)作為漁藥常用于驅(qū)除魚類腸道寄生蟲，治療草魚、鯽魚等魚類的絳蟲、毛細線蟲、棘頭蟲等寄生蟲疾病。阿苯達唑在動物體內(nèi)不穩(wěn)定，會在較短時間內(nèi)代謝為阿苯達唑亞砜（ABZSO）、阿苯達唑砜(ABZSO2)、阿苯達唑-2-氨基砜(ABZ-2NH2-SO2)［1］。阿苯噠唑及其代謝物的結(jié)構(gòu)如圖1所示。文獻［2］研究表明，動物給藥后4～10 d內(nèi)，阿苯達唑殘留只有20%～30%，其它殘留則以上述3種代謝物形式存在。代謝物的性質(zhì)給阿苯達唑及其代謝物的檢測帶來了較大的難度。目前，對養(yǎng)殖用漁藥的使用管理的日益加強，對其進行代謝和風險評估也更為重視。毒理學研究表明，阿苯達唑及其活性代謝物阿苯達唑亞砜具有致畸作用［3］。為進一步研究阿苯達唑在水產(chǎn)品體內(nèi)的代謝規(guī)律和保證水產(chǎn)品質(zhì)量安全，有必要建立一種快速、準確定量分析阿苯達唑及其代謝物的測定方法，以適應(yīng)科研和水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測需要。

檢測阿苯達唑常用方法主要有高效液相色譜法［4～7］和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS）［8～11］等。高效液相色譜法靈敏度相對較低，且需要用到離子對試劑作為流動相［5，6］。HPLC-MS方法靈敏度較高，但主要用于動物血漿中阿苯達唑的檢測，用于動物肌肉組織的方法較少。同位素內(nèi)標定量作為一種質(zhì)譜分析常用的方法，可有效提高方法回收率、精密度及定量準確度等。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）對草魚肉中阿苯達唑及其3種代謝物進行快速色譜分離和準確定性分析，利用氘代同位素內(nèi)標進行準確定量分析，可防止在測定過程中因阿苯達唑代謝降解帶來的定量偏差。本研究可為阿苯達唑及其代謝物的檢測及監(jiān)控提供一種快速準確、靈敏度高、重現(xiàn)性好的定量分析方法。

圖1 阿苯噠唑及其代謝物的結(jié)構(gòu)圖

Fig．1 Structures of albendazole (ABZ) and its metabolites

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

ACQUITYTM超高效液相色譜儀、QUATTRO Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，（美國waters公司）；T18勻漿機、MS2漩渦混合器（德國IKA公司）； Centrifuge 5810高速離心機（Eppendorf公司）；N-EVAP112氮吹儀（Organomation公司）；R-215 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）

實驗用水為Milli-Q制備高純水；甲醇、甲酸、乙酸乙酯、正己烷均為色譜純（Merk公司）；NaOH（分析純，上海試劑集團）；阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜、氘代阿苯達唑(D3-ABZ)、氘代阿苯達唑砜（D3-ABZSO2）標準品的純度＞98%（德國Dr公司）；其它試劑均為分析純。

2.2 標準溶液配制

2.2.1 ABZ及其代謝物標準儲備液和標準工作液 分別準確稱取4種標準品各10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，分別配成濃度均為100 mg/L的4種標準儲備液。避光冷藏保存，保存期為3個月。用甲醇將4種標準儲備液分別逐級稀釋成所需的混合標準工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2.2 氘代內(nèi)標工作液 取D3-ABZ和D3-ABZSO2標準物質(zhì)分別用甲醇配制100 mg/L標準儲備液，取內(nèi)標儲備液用甲醇配成100

SymbolmA@ g/L 混合內(nèi)標工作液。

2.3 樣品的制備

稱?。?±0.02）g 充分勻漿的樣品置于50 mL離心管中，加入100

SymbolmA@ L 100

SymbolmA@ g/L內(nèi)標工作液混勻。向離心管中加入15 mL 乙酸乙酯溶液和100

SymbolmA@ L 2 mol/L NaOH溶液，漩渦混合提取10 min， 以6000 r/min 離心5 min，收集上清液轉(zhuǎn)移至100 mL雞心瓶中，樣品殘渣用15 mL 乙酸乙酯溶液重復(fù)提取一次，合并上清液。上清液于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，向雞心瓶中加1 mL甲醇-水溶液（4∶6， V/V）超聲1 min以溶解殘渣。將雞心瓶中溶液轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中，加2 mL 正己烷渦旋混合2 min，以6000 r/min離心 5min，取水相溶液過0.22

SymbolmA@ m 濾膜后待測。

2.4 色譜-質(zhì)譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7

SymbolmA@ m）。流動相：A 為0.2%甲酸，B為甲醇。梯度洗脫：0～2.0 min， 90%～10% A; 2.0～3.0 min， 10% A; 3.0～4.0 min， 10%～90% A。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10

SymbolmA@ L。

第6期張小軍等： 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定草魚肉中阿苯達唑及其代謝物殘留

20  定量子離子（Quantitative ions）； ABZSO: Albendazole sulfoxide; ABZSO2: Albendazole sulfone; ABZ-2NH2- SO2: Albendazole aminosulfone。

離子源：電噴霧離子源，正離子掃描(ESI＋)；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細管電壓：3.5 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：380 ℃；錐孔氣流量：50 L/h；脫溶劑氣流量：600 L/h；目標物目標物母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量等質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測實驗條件如表1所示。阿苯達唑以D3-ABZ為內(nèi)標參照物，阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜以D3-ABZSO2為內(nèi)標參照物，阿苯達唑及其代謝物的含量按照內(nèi)標法由MASSLYNX軟件自動計算。

3 結(jié)果與討論

3.1 前處理方法選擇

阿苯達唑在動物體內(nèi)可代謝為阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜和阿苯達唑-2-氨基砜，各代謝物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)有顯著差異，因此需要找出合適的提取方法。通過對甲醇、乙酸乙酯、乙腈、K2CO3等提取劑的比較發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯對4種物質(zhì)均有較好的提取效果。阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜和阿苯達唑2-氨基砜在不同pH值的溶液中的電離度不同。選擇在pH 5.0、7.0和9.0條件下進行提取實驗。結(jié)果表明，在乙酸乙酯提取劑中加入100

SymbolmA@ L 2 mol/L NaOH，使提取液呈堿性（pH 9.0），在該條件下阿苯達唑及其3種代謝物均有較高的回收率。按照實驗方法提取、凈化的供試溶液每12 h測定一次，以評估供試溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，阿苯達唑、阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜在48 h內(nèi)測定值相對穩(wěn)定，阿苯達唑-2-氨基砜在24 h內(nèi)相對穩(wěn)定，各組分與理論濃度相比， 偏差均小于5%。

3.2 質(zhì)譜條件選擇

以1.0 mg/L的標準品溶液蠕動泵進樣選擇被測物的母離子和子離子，并對錐孔電壓、碰撞電壓、毛細管電壓等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化。在母離子掃描模式下，選擇母離子強度最大的錐孔電壓為最佳的錐孔電壓。在子離子掃描模式下，選擇強度最高的兩個子離子作為定性與定量子離子，同時選擇子離子強度最高時的碰撞能量為最佳的碰撞能量。ABZ及其3種代謝物的子離子掃描質(zhì)譜圖如圖2所示。經(jīng)實驗分析比較，ABZ及其3種代謝物的最佳母離子、子離子及電離條件、碰撞條件如表1所示。

圖2 阿苯達唑及其代謝物的子離子掃描圖

Fig．2 Daught scan spectra of ABZ and its metabolites

（A）阿苯達唑（ABZ）；（B）阿苯達唑亞砜（ABSO）；（C）阿苯達唑砜（ABSO2）；（D）阿苯達唑-2-氨基砜（ABZ-2NH2-SO2）。

3.3 阿苯達唑及其代謝物的色譜分離

采用甲醇和甲酸溶液作為流動相時，阿苯達唑及其代謝物有較好的峰型和響應(yīng)值。在用等度洗脫時，由于阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜結(jié)構(gòu)極為相似，二者不能完全分離。采用2.4節(jié)所示梯度進行洗脫，可將阿苯達唑及其3種代謝物完全分離，且出峰時間明顯縮短，可在4 min內(nèi)完成色譜分析。與普通高效液相色譜分離用時10～35 min［4～12］相比，分析時間明顯縮短。阿苯達唑及其3種代謝物的標準溶液質(zhì)譜離子流圖如圖3所示，4種物質(zhì)峰型尖銳對稱，響應(yīng)值和出峰時間均較為理想。

3.4 線性范圍和檢出限

用ABZ標準使用液配制濃度分別為0.05～10

SymbolmA@ g/L的標準工作溶液，進樣后制作標準曲線，計算線性方程，線性相關(guān)性及線性范圍。將空白樣品加標液逐級稀釋，取信噪比S/N＝3的樣品濃度為方法檢出限（LOD），取信噪比S/N＝10的樣品濃度為方法定量限(LOQ)。方法的線性范圍及檢出限見表2。結(jié)果表明，阿苯達唑及其代謝物在各自線性范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性，方法檢出限和定量限均可滿足實際檢測的需要。

3.5 方法回收率、精密度和特異性

在草魚肉樣品中進行3個濃度水平（0.5， 1.0和5.0

SymbolmA@ g/kg）的加標回收實驗，計算其回收率和精密度。日間精密度采用1.0

SymbolmA@ g/kg添加水平連續(xù)測定5 d，計算日間精密度。回收率和精密度結(jié)果如表3所示。4種物質(zhì)的平均回收率在97.1%～104.2%之間，日內(nèi)精密度均小于4.6%，日間精密度均小于3.0%。本方法的回收率顯著高于目前已有的質(zhì)譜分析方法(53%～77%［8］， 87.2%～91.1%［10］)。草魚肉樣品的基質(zhì)效應(yīng)采用空白樣品提取液加標的方法進行評估。通過空白草魚肉樣品的提取液與空白提取液加標

SymbolmA@ g/kg的色譜圖進行比較，各目標成分的偏差均小于10%，表明本方法的樣品基質(zhì)效應(yīng)對方法的影響并不明顯。此外，通過空白樣品色譜圖、空白加標樣品色譜圖與標準溶液色譜圖相比，草魚肉空白樣品色譜圖在目標物附近沒有發(fā)現(xiàn)明顯的雜峰，加標樣品的色譜圖與標準溶液色譜圖相似，沒有明顯的基質(zhì)干擾。以上結(jié)果表明，本方法基質(zhì)干擾小，重現(xiàn)性和精密度均可滿足藥物殘留分析的要求。

3.6 實際樣品檢測

在實驗室內(nèi)養(yǎng)殖的草魚人工給藥2 d后，利用本方法可檢出阿苯達唑及其3種代謝物。利用本方法對舟山水產(chǎn)品市場上隨機購得的草魚100條進行檢測，其中1個樣品呈陽性，阿苯達唑原藥未檢出，阿苯達唑砜、阿苯達唑亞砜和阿苯達唑-2-氨基砜含量分別為0.47， 1.31和1.16

SymbolmA@ g/kg。

4 結(jié) 論

建立了同時測定草魚肉中阿苯達唑及其3種代謝物（阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、阿苯達唑-2-氨基砜）的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）分析方法。草魚肉樣品中阿苯達唑及其代謝物通過堿性乙酸乙酯提取，正己烷凈化，獲得了較好的提取效果；本方法顯著縮短了色譜分析時間；采用串聯(lián)四級桿質(zhì)譜檢測，結(jié)果準確；利用氘代同位素內(nèi)標定量，提高了方法回收率和重現(xiàn)性，為阿苯達唑及其代謝物的檢測及監(jiān)控提供一種快速準確、靈敏度高、重現(xiàn)性好的定量分析方法。

References

1 Nathan R， Badar S. J. AOAC Int.， 1996， 79 (3) : 645～651

2 European Agency for the Evaluation of Medicinal Products， EMEA/MRL/247/97-FINAL， Albendazole Summary Report. 1997

3 Delatour P， Parish R. Benzimidazole Anthelmintics and Relate Dcompounds: Toxicity and Evaluation of Residues In Drug Residues in Animals. Orlando: Academic Press， 1986: 175～204

4 Badar S， Nathan R.J. Agric. Food Chem.， 2003， 51(11): 3254～3259

5 Dimitrios J， Elias P. J. Agric. Food Chem.， 2005， 53(4): 893～898

6 YU Hui-Juan， HUI Yun-Hua， HUANG Dong-Mei， GU Run-Run， WANG Yuan（于慧娟，惠蕓華，黃冬梅，顧潤潤，王 媛）. J. Anal. Sci（分析科學學報）， 2008， 24(6): 673～676

7 Georgios C， Georgios A.J. Chromatogr. B， 2004， 805(2): 267～274

8 Chen X， Zhao L， Xu H， Zhong D. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2004， 35(4): 829～836

9 Pierina S， Anderson R， Fernando J， Bruno J， Vera L， Armando E， Hector H， Osvaldo M. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2007， 44(2): 558～563

10 Pierina S， Vera L， Osvaldo M. J. Chromatogr. B， 2003， 783(1): 237～245

11 Titus A， Mathew M. Talanta， 2006， 69(1): 243～250

12 DU Hong-Ge， TAN Xu-Xin， FANG Zhong-Yi， ZHU Hong-Ji（杜紅鴿， 譚旭信， 方忠意， 朱紅繼）. Chinese J. Vet. Med. （中國獸藥雜志）， 2010， 44(1): 52～55

Determination of Albendzole and Its Metabolites in Grass Carp Meat by

Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Xiao-Jun1，2， ZHENG Bin3 ， ZHANG Hong2， YU Hai-Xia4， CHEN Xue-Chang2，

GUO Yuan-Ming1， MEI Guang-Ming2

1(Marine Fisheries Research lnstitute of Zhejiang Province， Zhejiang province

Key Lab of Mariculture Enhancement， Zhoushan 316100)

2(School of Food Science and Biotechnology， Zhejiang Gongshang University， Hangzhou 310035)

3(Zhejiang Marine Development Research Institute， Zhoushan 316100)

4(Zhejiang University Zhoushan Ocean Research Institute， Zhoushan 316000)

Abstract A method of ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) has been developed for the determination of albendzole(ABZ) and its metabolites， albendazole sulfoxide(ABZSO)， albendazole sulfone(ABZSO2) and albendazole aminosulfone(ABZ-2-NH2SO2) in grass carp meat. The samples were extracted with alkaline ethyl acetate and cleaned up by n-hexane. Chromatographic separation was achieved by UPLC and the detection was performed by tandem mass spectrometry using deuterated isotope internal standard. The UPLC-MS/MS analysis was rapid and can be achieved in less than 4 min. In the range of 0.1－10

SymbolmA@ g/kg， the analytes were in good linearity， and the correlation coefficients were 0.9991－0.9996. The recoveries of ABZ， ABZSO， ABZSO2 and ABZ-2-NH2SO2 spiked at levels of 0.5－5.0

SymbolmA@ g/kg， were 98.4%－102.6%， 97.1%－103.4%， 98.8%－103.7%， 101.1%－104.2%， the limit of quantity (LOQ ) were 0.2， 0.1， 0.2， 0.1

SymbolmA@ g/kg， respectively. The Intra-day RSD were less than 4.8%， and Inter-day RSD was less than 3.0%. The UHPLC-MS/MS method is rapid， sensitive， reproducible and suitable for the determination of ABZ and its metabolites

Keywords Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; Albendzole; Grass carp

(Received 11 October 2010; accepted 24 January 2011)