固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測食品中的6種工業(yè)染料

摘 要 建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）同時(shí)檢測食品中6種工業(yè)染料含量的方法。樣品用含50%甲醇和1%甲酸的50 mmol/L乙酸銨溶液進(jìn)行提取、WAX弱陰離子交換固相萃取柱進(jìn)行凈化后，采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式進(jìn)行檢測，基質(zhì)曲線外標(biāo)法定量。其中酸性橙Ⅱ采用負(fù)離子模式檢測，其余5種染料采用正離子模式檢測。堿性橙Ⅱ、羅丹明B、堿性嫩黃O、羅丹明6G、堿性桃紅T的定量限為1.6 線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。6種染料的回收率為70.3％～109.2％； 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.6%～14.1%。本方法靈敏度高，操作簡單高效，適合于食品中6種非法添加工業(yè)染料的定量及確證分析。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法； 堿性橙Ⅱ； 羅丹明B； 堿性嫩黃O； 堿性桃紅T； 羅丹明6G； 酸性橙Ⅱ； 食品

1 引 言

堿性橙Ⅱ、酸性橙Ⅱ、堿性嫩黃O和堿性桃紅T均屬于工業(yè)染料，主要用于家具、紙張、紡織品及化妝品的染色；羅丹明B和羅丹明6G是常用的指示劑和生物染色劑，廣泛應(yīng)用于環(huán)保、鋼鐵等領(lǐng)域。這些染料都有致癌、致畸、致突變性，嚴(yán)重危害人體健康[1～6]。工業(yè)染料被嚴(yán)格禁止添加于食品中，但不法商人在利益驅(qū)使下，將工業(yè)染料違法加入食品中用于染色[1～8]。如酸性橙Ⅱ被加入黃魚及腌制肉制品中，提高產(chǎn)品的賣相；堿性嫩黃O被加入豆制品中，使豆皮色澤光亮；羅丹明B被用于調(diào)味品中提高色澤。在我國衛(wèi)生部公布的食品中違法添加的物質(zhì)名單中[9]，含有上述工業(yè)染料中的4種。

檢測這6種染料方法有多種。液相色譜法應(yīng)用較廣；紫外法檢測樣品前處理要求低、凈化簡易，但靈敏度低、定性能力差，假陽性率高；熒光法可以達(dá)到較高的靈敏度，但只有少數(shù)的染料是具有熒光特性的化合物，多殘留檢測需要設(shè)備具有可變波長的功能，方法的適用性差[2～5]。液相色譜-質(zhì)譜檢測法比液相色譜法具有更高的靈敏度及選擇性，現(xiàn)已成為一種比較認(rèn)可的技術(shù)用于檢測食品中非法添加染料。但是現(xiàn)有的研究多為一種或單類成分的檢測，并且方法適用的食品種類有限，難以推廣[6～14]。卓婧等采用分光光度法研究了食品中合成色素的檢測方法，可對(duì)多種色素快速測定[15]。本研究以WAX固相萃取柱凈化處理，UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測和確證食品中6種工業(yè)染料（堿性橙Ⅱ、酸性橙Ⅱ、堿性嫩黃O、堿性桃紅T、羅丹明B和羅丹明6G）的方法。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

ACQUITY Quattro Premier XE超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；LABOROTA 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司）；Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）；TGL-10C高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

堿性嫩黃O、堿性桃紅T、堿性橙Ⅱ（純度＞98%，美國Acros organics公司），酸性橙Ⅱ鈉鹽、羅丹明B、羅丹明6G（純度＞94%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）。分別稱取適量染料標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇-水（1∶1，V/V）溶解并定容至50 mL，配制成100 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液，再將其配制成6種工業(yè)染料的10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)液，使用前逐級(jí)稀釋。

甲醇、甲酸均為色譜純；氨水、乙酸銨均為優(yōu)級(jí)純；Oasis WAX 固相萃取柱（60 mg，3 mL，Waters 公司）；提取溶液：50 mmol/L乙酸銨溶液，含50%（V/V）甲醇、1%（V/V）甲酸；固相萃取柱平衡溶液：50 mmol/L乙酸銨溶液，含1%（V/V）甲酸；固相萃取柱淋洗溶液：50 mmol/L乙酸銨溶液，含5%（V/V）甲醇、1%（V/V）甲酸。

2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g均勻試樣于50 mL離心管中，加入10 mL提取溶液，超聲提取30 min，以5000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中；殘?jiān)性偌尤?0 mL提取溶液，均質(zhì)后重復(fù)上述操作，合并兩次上清液。加入5 mL正己烷，振蕩3 min，以5000 r/min離心5 min，棄去正己烷層。

將WAX 固相萃取柱用3 mL甲醇，3 mL水，3 mL 固相萃取柱平衡溶液進(jìn)行活化，準(zhǔn)確吸取5.0 mL樣品提取液于燒杯中，加入30 mL平衡溶液混勻稀釋，過WAX 固相萃取柱；依次用3 mL 固相萃取柱淋洗溶液、3 mL水淋洗；用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液A；用3 mL氨水-甲醇（5∶95， V/V）洗脫，收集洗脫液B；分別用氮?dú)鈱⑾疵撘篈和B吹至近干，甲醇-水（1∶1， V/V）定容至1.0 mL，過0.22

對(duì)目標(biāo)化合物保留較好。分別使用10 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸-乙腈和10 mmol/L乙酸銨-乙腈作為流動(dòng)相，在ESI（＋）模式下，各組分峰面積無明顯差別，但考慮到流動(dòng)相加酸對(duì)ESI（－）模式的影響，本研究選擇10 mmol/L乙酸銨-乙腈作為流動(dòng)相。選擇0.25 和0.30 mL/min考察流速，發(fā)現(xiàn)流速為0.25 mL/min時(shí)，分離效果更佳。

3.2 固相萃取方法的選擇和優(yōu)化

6種染料在反相C18色譜柱上均有較強(qiáng)的保留，可以使用反相機(jī)理固相萃取柱進(jìn)行凈化。對(duì)3種固相萃取柱OASIS MCX、OASIS WAX和Cleanert COOH-SPE進(jìn)行了選擇：堿性嫩黃O、堿性桃紅T、堿性橙Ⅱ、羅丹明B和羅丹明6G在OASIS MCX和Cleanert COOH-SPE固相萃取柱上的回收率較好，但酸性橙Ⅱ保留性差，從上樣開始就有流失；在WAX固相萃取柱上，各種組分的回收率均較理想。因此，本研究選擇了兼有反相機(jī)理和弱陰離子交換機(jī)理的WAX固相萃取柱進(jìn)行凈化。

以WAX固相萃取柱進(jìn)行樣品凈化時(shí)，當(dāng)上柱溶液中甲醇含量超過10%時(shí)，堿性桃紅T從上樣開始就流失；當(dāng)甲醇濃度達(dá)到50%時(shí)，除酸性橙Ⅱ外，其它目標(biāo)物柱保留僅為40%～70%（圖1）。因此，本研究選擇了甲醇含量小于10%的緩沖鹽溶液作為上柱溶液，含5%甲醇的緩沖鹽溶液作為淋洗液

6種染料在氮?dú)庀麻L時(shí)間加熱均會(huì)有損失，堿性橙Ⅱ下降最明顯（圖2）。因此洗脫溶液濃縮時(shí)不能吹干，且時(shí)間控制在30 min內(nèi)。6種染料SPE凈化時(shí)采用分步洗脫，先用甲醇洗脫堿性橙Ⅱ、羅丹明B、堿性嫩黃O、羅丹明6G和堿性桃紅T，再用氨化甲醇洗脫酸性橙Ⅱ，兩步洗脫單獨(dú)濃縮，減少了試劑用量，縮短了濃縮時(shí)間，有利于提高回收率。

3.3 質(zhì)譜條件的選擇

用甲醇-水（1∶1， V/V）配制1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在質(zhì)譜上先進(jìn)行全掃描，在ESI（＋）模式下得到堿性橙Ⅱ、羅丹明B、堿性嫩黃O、羅丹明6G和堿性桃紅T的分子離子峰，母離子分別為m/z 213.1， 443.1， 268.3， 443.1和315.1；在ESI（－）模式下得到酸性橙Ⅱ的分子離子峰，母離子為m/z 327.0。再通過優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)得到6種染料的子離子。6種染料的定量和定性子離子及相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

3.4 線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

采用基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量。根據(jù)基質(zhì)的不同，按上述方法進(jìn)行提取、凈化和濃縮，采用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行定容、檢測，得到基質(zhì)加標(biāo)工作曲線。實(shí)驗(yàn)表明，堿性橙Ⅱ、羅丹明B、堿性嫩黃O、羅丹明6G和堿性桃紅T的線性范圍為1.0～100

4 結(jié) 論

采用含50%甲醇和1%甲酸的50 mmol/L的乙酸銨溶液提取目標(biāo)物、WAX固相萃取柱去除雜質(zhì)，可基本排除食品樣品對(duì)離子化的影響；采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度好，最終建立了食品中堿性橙Ⅱ、羅丹明B、酸性橙Ⅱ、堿性嫩黃O、羅丹明6G和堿性桃紅T的同時(shí)檢測方法。與已有方法相比，本方法適用范圍更廣、抗干擾能力更強(qiáng)、定性和定量更加準(zhǔn)確，適合于食品中6種非法添加工業(yè)染料的檢測。

References

1 LU Shi-Ying， ZOU Ming-Qiang（盧士英，鄒明強(qiáng)）. China Instrumentation（中國儀器儀表）， 2009， 8: 45～50

2 ZHANG Xiu-Rao， CAI Xin-Xin（張秀堯，蔡欣欣）. Chinese Journal of Health Laboratory Technology （中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志）， 2004， 14（2）: 204

3 LIN Qin（林 欽）. Chinese Journal of Chromatography （色譜）， 2007， 25（5）: 776～777

4 LIN Qin， ZHENG Xiao-Yan， HE Shu-Kun， DAI Ming， XIE Yong （林 欽，鄭小嚴(yán)，何樹坤，戴 明，謝 勇）. Food Science（食品科學(xué)）， 2009， 30（14）: 194～196

5 GAO Jie， NING Shang-Yong， XU Zhi-Qiang（高 潔，寧尚勇，許志強(qiáng)）. Chinese Journal of Analysis Laboratory （分析試驗(yàn)室）， 2008， 27（8） : 33～35

6 ZHANG Hai-Qi， LIANG Li-Jun， HE Zhong-Yang， SHI Li-Ke（張海琪，梁麗軍，何中央，施禮科）. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society（質(zhì)譜學(xué)報(bào)）， 2010， 31（1）: 48～52

７ ZHENG Xiao-Yan（鄭小嚴(yán)）. Journal of Analytical Science（分析科學(xué)學(xué)報(bào)）， 2009， 25（4）: 409～413

８ Ministry of Health of the People′s Repubic of China （中華人民共和國衛(wèi)生部）． Food may be illegal and easy to add non-food substances of abuse list of food additives（食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單）[2011-05-12] http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsjdj/s9164/201104/51441.htm

９ Tateo F， Bononi M. J. Agric. Food Chem.， 2004， 52（4）: 655～658

1０ Calbiani F， Careri M， Elviri L， Mangia A， Zagnoni I. J. Chromatogr. A， 2004， 1058（1-2）: 127～135

1１ LIU Hua-Liang， RONG Wei-Guang， WANG Lian-Hong， JI Wen-Liang， MA Yong-Jian（劉華良，榮維廣，王聯(lián)紅，吉文亮，馬永建）. Chinese Journal of Food Hygiene（中國食品衛(wèi)生雜志）， 2010， 22（1）: 16～18

1２ ZHAO Shan， ZHANG Jin， YANG Yi， SHAO Bing（趙 珊，張 晶，楊 奕，邵 兵）. Chinese Journal of Chromatography（色譜）， 2010， 28（4）: 356～362

1３ Kandler H， Bleisch M， Widmer V， Reich E. Journal of Liquid Chromatography Related Technologies， 2009， 32: 1273～1288

14 Carmen Ferrer， Amadeo R. Fernandez-Alba， Imma Ferrer. Inter. J. Environ. Anal. Chem.，2007， 87（13-14）: 999～1012

15 ZHUO Jing， WANG Jing， CHEN Xiao-Xia， TANG Xin-Hua， QIU Bin， ZHU Er-Yi， CHEN Xi（卓 婧， 王 靜， 陳小霞， 湯新華， 邱 彬， 朱爾一， 陳 曦）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學(xué)）， 2011， 39（2）: 283～287

Simultaneous Determination of 6 Industrial Dyes in Foods by

Solid Phase Extraction-Ultra Performance Liquid

Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CAO Peng1，2， QIAO Xu-Guang*1， LOU Xi-Shan3， GENG Jin-Pei2， FU Jian3， ZHANG Xi-Qing3

1（College of Food Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Taian 271018）

2（Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Yantai 264000）

3（Yantai Jieke Inspection Service Co.， Ltd， Yantai 265231）

Abstract An ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric method was established for the simultaneous determination of the residues of six industrial dyes in foods. The samples were extracted with 50 mmol/L ammonium acetate solution containing 50% methanol and 1% formic acid， cleaned up by WAX solid phase extraction column， and then analyzed in multiple reaction monitoring （MRM） mode. Sample matrix-matched calibration was used to determine the residue contents by external standard. OrangeⅡwas detected with negative ion model， and the other five dyes were detected with positive ion model. Limit of quantitation （LOQ） of ChrysoidineⅡ， Rhodamine B ， Auramine O ， Rhodamine 6G and Safranine T was 1.6