高效毛細(xì)管電泳法同時(shí)測定減肥類功能食品中7種違禁成分

摘 要 建立了同時(shí)測定減肥類功能食品中違禁成分芬氟拉明、偽麻黃堿、去甲偽麻黃堿、安非拉酮、西布曲明、西地那非和士的寧的高效毛細(xì)管電泳分析方法。以20 mmol/L硼砂-10 mmol/L SDS-5%乙腈溶液（pH 9.0）為運(yùn)行緩沖液，在25 ℃，17 kV條件下測定，檢測波長為195 nm。各待測物線性范圍上限均為100 mg/L，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.998，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.5%～7.9%（n＝7）; 平均加標(biāo)回收率為79.6%～112.0%; 檢出限（S/N＝3）為0.16～0.65 mg/L。本方法簡便快速、靈敏準(zhǔn)確、分析成本低，已成功應(yīng)用于功能食品中上述減肥類違禁添加成分的測定。

關(guān)鍵詞 高效毛細(xì)管電泳法；減肥功能食品；違禁成分

1 引 言

功能食品也稱保健食品，是指具有保健或預(yù)防疾病功效的加工食品。個(gè)別生產(chǎn)商為使功能食品在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到所宣稱的效果，違法加入一種或多種具有相應(yīng)功能的違禁藥物，如芬氟拉明（Fenfluramine）[1]、偽麻黃堿（Pseudoephedrine）[2]、去甲偽麻黃堿（Norpseudoephedrine）[2]、安非拉酮（Amfepramone）[3]、西布曲明（Sibutramine）[1]、西地那非（Sildenafil）[4]和士的寧（Strychnine）[5]等。這些非法添加成分對人體健康危害極大。我國和美國、日本等都有因食用了添加這些違禁成分的功能食品而致死的報(bào)道。因此，為保護(hù)消費(fèi)者的健康，有效監(jiān)督功能食品質(zhì)量，有必要建立功能食品中多種違禁添加成分同時(shí)快速檢測方法。

目前，對上述化合物的單獨(dú)測定或某幾個(gè)化合物同時(shí)測定方法較多，主要有液相色譜法[6～10]，液相色譜-質(zhì)譜法[11～13]和氣相色譜-質(zhì)譜法[14，15]等。高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）是近年發(fā)展快速的一種分析技術(shù)，是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，與HPLC及LC-MS相比較，具有分離能力強(qiáng)、操作簡便和分析成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。李潤鍇等[16]使用HPCE法測定了性保健品中的西地那非，楚清脆等[17]應(yīng)用HPCE法測定了感冒藥中的鹽酸偽麻黃堿，但采用HPCE法同時(shí)測定功能食品中上述7種化合物未見報(bào)道。本研究通過固相萃取凈化、毛細(xì)管電泳分離、紫外檢測，建立了快速檢測減肥類功能食品中上述7種違禁添加成分的分析方法，用于實(shí)際樣品的測定，結(jié)果滿意。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

濾膜過濾后，取4 mL待固相萃取凈化。固相萃取小柱依次以3 mL 0.1%甲酸-甲醇溶液和3 mL 2%甲酸溶液活化。上樣后，依次用2 mL 2%甲酸溶液，2 mL 30%甲醇溶液，1 mL甲醇淋洗雜質(zhì)和色素。此后用6 mL 2%氨水-甲醇溶液（臨用新配）洗脫待測物，收集洗脫液。固相萃取過程不施加真空，滴速不超過5 mL/min。淋洗液于40 ℃水浴中由弱氮?dú)獯抵两?，?.01 mol/L HCl溶解并定容至0.20 mL，以10000 r/min離心后供HPCE測定。

2.3 電泳條件

毛細(xì)管在使用前，依次用純水、0.1 mol/L NaOH、純水、緩沖液加壓沖洗各3 min。測定時(shí)，設(shè)置溫度25 ℃，17 kV，檢測波長195 nm。每次分析結(jié)束后，緩沖液加壓沖洗3 min，再進(jìn)行下一次分析。壓力差（重力）進(jìn)樣13 s。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)系列的制備

以100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液配制5.0，10.0，25.0，50.0，75.0和100 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

2.5 定性與定量分析

以遷移時(shí)間定性，外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。以違禁添加成分標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度對峰面積進(jìn)行線性回歸得回歸方程。根據(jù)試樣的峰面積由回歸方程計(jì)算得進(jìn)樣液中待測違禁成分的質(zhì)量濃度，再根據(jù)稱樣量及稀釋倍數(shù)，計(jì)算樣品中待測違禁成分的含量（以mg/kg表示）。

3 結(jié)果與討論

3.1 最佳電泳條件的選擇

3.1.1 緩沖液及其pH 為改善峰型和分離效果，消除溶劑峰對分離的影響，加入表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）[18]。SDS具有吸附、增溶、形成膠束等功能?？捎米魇杷苜|(zhì)的助溶劑、離子對試劑或管壁表面改性劑，還可影響電滲流。當(dāng)加入SDS的量超過其臨界膠束濃度（8.2 mmol/L）時(shí)，其在水中聚成球形膠束，電荷朝外，烷基藏于內(nèi)部，其作用類似于色譜固定相。此時(shí)，毛細(xì)管電泳分離方式發(fā)生改變，成為膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MEKC或MECC）。實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度SDS對分離的影響，發(fā)現(xiàn)隨SDS濃度的增加，分離度提高，溶劑峰提前，但遷移時(shí)間延長（圖1中a和b）。當(dāng)加入SDS超過其臨界膠束濃度達(dá)到10 mmol/L時(shí)，7種待測成分均完全分離（圖1c）。綜合考慮分離度及分析時(shí)間，最后確定SDS的濃度為10 mmol/L。此時(shí)，毛細(xì)管電泳的分離模式為MEKC。實(shí)驗(yàn)中加入不同量乙腈觀察其峰形的影響，結(jié)果表明，乙腈對分離度影響不明顯，但可改善峰形。當(dāng)其含量為5%時(shí)，峰形最佳。

加入0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)運(yùn)行緩沖液pH值，發(fā)現(xiàn)隨著pH值降低，鹽酸偽麻黃堿與去甲偽麻黃堿的分離度下降?？紤]到運(yùn)行緩沖液本身pH≈9.0，而過高pH值會縮短毛細(xì)管使用壽命，故未通過調(diào)節(jié)pH值改善分離度。

3.1.2 進(jìn)樣時(shí)間 采用壓力差進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)間影響方法的靈敏度?？疾炝?0～15 s內(nèi)峰面積的變化。在10～13 s，隨著進(jìn)樣時(shí)間增加，峰面積變大，靈敏度增加，且分離效果穩(wěn)定；13～15 s，由于進(jìn)樣體積變大，進(jìn)樣時(shí)間延長，峰形變寬，分析物出現(xiàn)擴(kuò)散，分離度變差。故進(jìn)樣時(shí)間選擇為13 s。

3.1.3 分離電壓 溫度的改變可引起遷移時(shí)間及分離度的變化[18]。將溫度控制在25 ℃。在25 ℃下，考察了電壓對分離效果的影響，在11～20 kV范圍內(nèi)，隨著電壓升高，遷移時(shí)間縮短。在17 kV時(shí)，各化合物均得到良好分離。故分離電壓選擇為17 kV。

3.2 樣品前處理方法

功能食品組成復(fù)雜，特別是以減肥茶等樣品基體干擾嚴(yán)重。為消除干擾，提高靈敏度，采取固相萃取的方法凈化樣品。因被測物質(zhì)均為有機(jī)弱堿，所以，可用弱酸水溶液提取，然后用強(qiáng)陽離子交換柱凈化樣品，由氨化甲醇洗脫被測物。

SPE柱經(jīng)活化后上樣，為盡量洗去色素等雜質(zhì)，先用2%甲酸溶液淋洗，但不能完全洗去，又嘗試使用甲醇淋洗。結(jié)果表明，隨著甲醇比例的增加，色素等雜質(zhì)越易淋洗掉。但甲醇含量過高，又使西布曲明被洗脫，造成損失。當(dāng)用2 mL 30%甲醇淋洗時(shí)，再加上1 mL純甲醇，能使色素等雜質(zhì)基本洗脫，而又不使被測物流出，故本法確定的固相萃取淋洗時(shí)依次用2 mL 2%甲酸、2 mL 30%甲醇和1 mL甲醇淋洗雜質(zhì)和色素。此后用6 mL 2%氨水-甲醇溶液（臨用新配）淋洗待測物。

比較了3種不同濃度（0.5%， 2%和5%）氨化甲醇對7種待測組分的洗脫效率。結(jié)果表明，3種濃度洗脫液均能完全洗脫待測組分。但隨著氨水比例增加，洗脫體積減小，但基體干擾增大，綜合考慮選取6 mL 2%氨化甲醇作為洗脫液。此時(shí)各待測物洗脫率為芬氟拉明93.4%，去甲偽97.8%，偽麻黃堿93.8%，安非拉酮97.5%，西布曲明94.1%，士的寧95.1%，西地那非97.8%。

3.3 方法線性回歸方程、檢出限和精密度

配制0，5.00，10.0，25.0，50.0，75.0和100 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（y）對含量（x）進(jìn)行線性回歸，各組分的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.998，表明7種違禁成分在0～100 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。以基線噪聲的3倍響應(yīng)值對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液含量計(jì)算得各組分方法檢出限為0.16～0.65 mg/L。在同樣條件下測得日內(nèi)及日間精密度結(jié)果見表1。

3.4 方法回收率

對實(shí)際樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。取適量樣品混勻，稱取12份平行樣，其中3份用作本底測定，其余9份按高、中、低水平加入各組分標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后以2.2節(jié)進(jìn)行樣品處理和測定，測得的加標(biāo)回收率見表2。

3.5 樣品分析

用本法對不同廠家的7種樣品，包括3種減肥膠囊，2種減肥茶和2種減肥片進(jìn)行了檢測。在某膠囊樣品中檢出西地那非，含量為56 mg/kg；另一減肥茶樣品中測出芬氟拉明，含量為7 mg/kg。

本研究報(bào)道的HPCE法具有簡便、快速、準(zhǔn)確、成本低等特點(diǎn)。樣品經(jīng)SPE凈化濃縮后，可消除大部分干擾，且靈敏度顯著提高，適用于減肥類功能食品中違禁成分的分析。

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Simultaneous Determination of Seven Adulterants in Slimming Functional

Foods by High Performance Capillary Electrophoresis

LI Yang， XUE Feng， WANG Yuan， XUE Yong， SUN Cheng-Jun*

（West China School of Public Health， Sichuan University， Chengdu 610041）

Abstract A method for the simultaneous determination of seven adulterants including fenfluramine， pseudoephedrine， norpseudoephedrine， amfepramone， sibutramine， sildenafil and strychnine in slimming functional foods has been established. A mixture of 20 mmol/L sodium tetraborate-10 mmol/L SDS-5% acetonitrile was used as running buffer （pH 9.0）. The samples were analyzed by high performance capillary elctrophoresis under conditions of 17 kV; 25 ℃ with the detection wavelength of 195 nm. The upper limits of linear ranges were all 100 mg/L with linear correlation coefficients greater than 0.998. The RSDs were 4.5%－7.9% （n＝7）. The average recoveries were 79.6%－112.0%. The detection limits （S/N＝3） were 0.16－0.65 mg/L. The method is simple， fast， sensitive， accurate， low cost and has been successfully applied to the determination of the 7 target chemicals in the slimming functional foods.

Keywords High performance capillary electrophoresis; Slimming functional foods; Adulterant