空氣動力輔助離子化新型質(zhì)譜技術(shù)用于藥物快速實時分析的研究

摘 要 采用自主研制的新型空氣動力輔助離子化質(zhì)譜技術(shù)（AFAI-MS）及其裝置，對違法飼料添加的未知藥片進(jìn)行了快速實時質(zhì)譜分析，并對其中的藥效成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定研究。通過本技術(shù)快速、高效地獲取了藥片中有效成分的一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜、分子離子的精確質(zhì)量數(shù)等關(guān)鍵結(jié)構(gòu)信息。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合“抗膽堿”的藥理作用以及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果，分析推斷出該藥效成分為山莨菪堿；并結(jié)合對照品比對分析，最終確定該未知藥片為山莨菪堿片。本方法為藥物相關(guān)領(lǐng)域中復(fù)雜樣品的快速實時檢測提供了有效的分析途徑，并為打擊藥品違法添加提供了重要的分析依據(jù)。

關(guān)鍵詞 空氣動力輔助離子化技術(shù); 質(zhì)譜分析; 復(fù)雜樣品; 快速實時分析; 山莨菪堿

1 引 言

復(fù)雜樣品的快速實時分析是現(xiàn)代分析化學(xué)所面臨的難點問題，也是已經(jīng)引起廣泛關(guān)注的關(guān)鍵課題。目前，對于復(fù)雜樣品的分析常采用萃取、純化、色譜分離等復(fù)雜的前處理手段，同時結(jié)合在線檢測技術(shù)進(jìn)行分析，耗時耗材。其中，液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS及LC-MS/MS）是復(fù)雜混合物分析的有效手段之一，并已發(fā)揮了重要作用[1，2]。對于絕大多數(shù)質(zhì)譜技術(shù)而言，從待測物離子產(chǎn)生到獲得離子的響應(yīng)信號僅需要毫秒級的時間，但是樣品的前處理過程已成為制約現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)分析效率的關(guān)鍵因素[3]。

近年來，無需復(fù)雜前處理、在樣品原始環(huán)境、離子源敞開條件下實現(xiàn)離子化的質(zhì)譜技術(shù)（Ambient mass spectrometry）已成為質(zhì)譜學(xué)領(lǐng)域的前沿而備受關(guān)注，其中敞開式離子化技術(shù)（Ambient ionization）及其裝置是最關(guān)鍵部分[4，5]。自2004年美國Cooks教授研究小組和2005年日本電子（美國）公司分別開發(fā)出解吸電噴霧技術(shù)（DESI）[6，7]和實時直接分析技術(shù)（DART）[8]以來，該類新型離子化技術(shù)的研制取得了迅速發(fā)展。例如，已相繼研發(fā)出大氣壓介質(zhì)阻擋放電電離（DBDI）[9]，萃取電噴霧電離（EESI）[10]、低溫等離子探頭（LTP）[11，12]，解吸大氣壓化學(xué)電離（DAPCI）[13]，電噴霧輔助激光解吸電離（ELDI）[14]、基質(zhì)輔助激光解吸電噴霧電離（MALDESI） [15]， 大氣壓固體分析探頭（ASAP） [16] 和激光消融電噴霧電離（LAESI）[17]等離子化技術(shù)。這些新型離子化技術(shù)實現(xiàn)了離子源敞開式操作，省去了復(fù)雜的樣品前處理過程，對樣品的直接原位分析具有重要意義，并已在國家安全、公共安全、醫(yī)藥和商檢等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。

本課題組設(shè)計并開發(fā)出一種可用于遠(yuǎn)距離質(zhì)譜分析的敞開式空氣動力輔助離子化技術(shù)及其裝置（Air flow assisted ionization，AFAI）[18]。該技術(shù)可在敞開條件下，提高帶電液滴的采集與傳輸效率、增加帶電液滴的傳輸距離、同時促進(jìn)帶電液滴脫溶劑，并在質(zhì)譜儀采集口富集后最終實現(xiàn)高效率的離子化。這種新型AFAI技術(shù)提高了遠(yuǎn)距離敞開式樣品的離子化效率和檢測靈敏度，擴(kuò)展了樣品分析的空間和靈活性，增強(qiáng)了對大體積物品和遠(yuǎn)距離目標(biāo)物的分析能力。

藥物快速分析是藥品質(zhì)量控制、藥品打假、監(jiān)控保健品非法添加、藥物濫用控制、法醫(yī)等研究領(lǐng)域的重要環(huán)節(jié)。采用上述多種敞開式離子化質(zhì)譜技術(shù)對一些不同類型的已知藥片進(jìn)行快速質(zhì)譜分析，取得了很好的研究進(jìn)展[18～20]，獲取的信息與其中藥效成分的結(jié)構(gòu)一致。本研究采用無需前處理的快速質(zhì)譜技術(shù)AFAI-MS直接分析并鑒定未知藥片。該未知藥片被非法用于生豬出欄前飼喂，減少排尿，以提高豬肉中的水分含量。本研究快速獲取了該藥片中有效成分的一級質(zhì)譜（MS）、二級質(zhì)譜（MS/MS）、高分辨質(zhì)譜分析的精確質(zhì)量數(shù)，分析推斷所含未知藥物的可能結(jié)構(gòu)，并利用對照品進(jìn)行比對分析，最終確定了該藥片的有效成分及其結(jié)構(gòu)。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

采用自主研制的AFAI離子源裝置，其詳細(xì)的設(shè)計參數(shù)與搭建過程請參考文獻(xiàn)[18]。AFAI離子源裝置分別安裝在QTRAPTM型四極桿-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀（Applied Biosystems/MDS SCIEX，美國AB公司） 和AccuTOF CS質(zhì)譜儀 （JMS T100CS，日本電子公司）上，原商業(yè)離子源被移除后，直接安裝AFAI離子源。在敞開模式下，采用ESI毛細(xì)管產(chǎn)生初始帶電液滴，并將其直接作用于藥片上，樣品解析后產(chǎn)生的二次帶電液滴經(jīng)高速空氣流帶入傳輸管，并傳輸至質(zhì)譜儀采集錐，然后進(jìn)入分析器實現(xiàn)質(zhì)譜分析。數(shù)據(jù)分析在Analyst 1.5和Masscenter 1.3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中進(jìn)行。

噴霧溶劑體系選用甲醇（色譜純，德國Merk公司）-水（純凈水）＋0.1%甲酸（色譜純，德國Merk公司， 體積比為80∶20。未知藥片是從飼養(yǎng)場獲取的非法飼料添加劑。對照品山莨菪堿購自中國藥品生物制品檢定所。

2.2 樣品分析及測試條件

質(zhì)譜條件：兩臺質(zhì)譜儀均采用正離子檢測方式，掃描質(zhì)量范圍m/z 50～1000，每張譜的采集時間2 s。在QTRAP質(zhì)譜儀上，采用Q1和子離子（Product ion）掃描模式，分別采集MS和MS/MS譜數(shù)據(jù)，分辨率為單位質(zhì)量分辨。噴霧電壓 5.5 kV；電壓 80 V，原離子源加熱參數(shù)、GS1和GS2均設(shè)為0值，即關(guān)閉加熱和氣流；Interface heater設(shè)定為ON。MS/MS碰撞能量（CE）42 eV。在AccuTOF CS質(zhì)譜上，采用TOFMS掃描模式采集高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，分辨率大于6000（50%峰）；噴霧電壓4 kV，錐孔1電壓和溫度分別為80 V和80 ℃。錐孔2電壓和環(huán)形透鏡電壓分別為5和 20 V。

3 結(jié)果與討論

采用自制的AFAI技術(shù)在DESI模式下對未知藥片進(jìn)行了快速直接質(zhì)譜分析（圖2a）。由圖2a可以觀察到非常明顯的m/z 306離子和其它離子，其中，m/z 279、205和149是常見的背景離子。該結(jié)果提示，m/z 306離子可能與未知藥片中的藥效成分相關(guān)，且為[M＋H]＋離子峰，則推斷該化合物的相對分子質(zhì)量為305 Da。在AFAI-DESI方式下，對m/z 306進(jìn)行了MS/MS譜分析，其結(jié)果見圖2b，可以觀察到m/z 158、140、122、109和103的子離子。根據(jù)質(zhì)譜氮規(guī)則，表明該化合物中含有奇數(shù)個氮原子。

為關(guān)鍵詞在網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行檢索，該化合物可能為山莨菪堿，其分子式為C17H23NO4。

采用AFA-DESI-MS方法進(jìn)一步對該未知藥片進(jìn)行了高分辨質(zhì)譜分析及精確質(zhì)量數(shù)的測定，以已知背景離子m/z 301.1416（C16H22O4Na）為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量校正，獲得如圖3所示的結(jié)果。

經(jīng)測定該未知藥片中主要成分m/z 306離子的精確質(zhì)量數(shù)為306.1715，山莨菪堿的[M＋H]＋離子理論精確質(zhì)量數(shù)為306.1705，二者的相對誤差為3.26 ppm。本分析結(jié)果進(jìn)一步表明該未知藥片的藥效成分為山莨菪堿。

以上結(jié)果表明，AFAI-MS新技術(shù)可以藥品中輔料等基質(zhì)干擾存在的情況下，簡便、快速地獲得藥片中藥效成分的結(jié)構(gòu)信息，實現(xiàn)無需前處理的直接實時質(zhì)譜分析。另外，從本研究的過程及經(jīng)驗來看，對于復(fù)雜樣品中未知組分的結(jié)構(gòu)分析，首先可采用AFAI-MS等敞開式離子化質(zhì)譜技術(shù)，快速發(fā)現(xiàn)及確定混合物中的目標(biāo)分析成分，并結(jié)合

HRMS， MS/MS（MSn）譜等手段分析獲取目標(biāo)成分的相對分子質(zhì)量及化學(xué)式、子離子等關(guān)鍵結(jié)構(gòu)信息；其次，了解樣品的相關(guān)藥理作用、用途和來源等重要化學(xué)背景信息；然后根據(jù)相對分子質(zhì)量、化學(xué)式、MS/MS（MSn）裂解特征等信息，分析推斷目標(biāo)成分的可能結(jié)構(gòu)；最終通過對照品比較分析其MS、HRMS、MS/MS譜，予以確證。

本研究以自主研制的新型空氣動力輔助離子化質(zhì)譜技術(shù)（AFAI-MS）為主要手段，實現(xiàn)了未知藥片的快速、直接實時分析。根據(jù)獲得的一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜、精確質(zhì)量數(shù)等關(guān)鍵結(jié)構(gòu)信息，并結(jié)合相關(guān)的藥理作用和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫搜索，分析推斷出該藥片所含藥效成分為山莨菪堿；并利用對照品比對分析，最終確定了該未知藥片為山莨菪堿片。本研究結(jié)果為打擊藥品非法添加提供了重要的分析依據(jù)，并顯示出AFAI-MS新技術(shù)具有簡便、快速的分析優(yōu)勢。

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Fast and Direct Analysis of Active Ingredient in Unknown Tablet Using

Air Flow Assisted Ionization-Mass Spectrometry

HE Jiu-Ming， LUO Zhi-Gang， LI Nong， ZHANG Rui-Ping， HE Jing-Jing， ZEPER ABLIZ*

（State Key Laboratory of Bioactive Substances and Functions of Natural Medicines， Institute of Materia Medica，

Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100050）



Abstract A procedure was described for the fast and direct structural identification of active ingredients in an unknown tablet， which was illegally used as feed additive. The mass spectra， product ion spectra and accurate mass measurement results were acquired by the fast and direct MS analysis of the tablet with a homemade air flow assisted ionization （AFAI） coupling with commercial available mass spectrometers. From these results， the key structure information （molecular weight and formula） of the active ingredient was proposed， and then \"cholinolytic effect\" and \"molecular weight 305\" were used as the key word for the information search on the internet. The search results indicated that the active ingredient is raceanisodamine. Finally， the comparison between the MS/MS spectra of the unknown tablet and that of reference raceanisodamine was carried out， and it was confirmed that the unknown tablet is raceanisodamine. The results provided an important evidence to deal with the illegal usage pharmaceuticals as feed additive. AFAI-MS would be a rapid and effective method for the analysis of complex mixture in the field related to pharmaceuticals.

Keywords Air flow assisted ionization; Mass spectrometry; Complex mixture; Fast analysis; Raceanisodamine.