基于雙分子識別熒光猝滅法高選擇性測定多巴胺

摘 要 制備了以二硫基琥珀酰亞胺丙酸酯，4-巰基苯硼酸功能化CdTe量子點探針，對其進行了X-射線光電子能譜和透射電鏡表征。在431 nm激發(fā)波長下，對探針及加入多巴胺后進行發(fā)射光譜掃描，最大發(fā)射峰紅移，在最大發(fā)射波長處，多巴胺對合成的探針具有猝滅效應(yīng)，且多巴胺對體系的猝滅程度與多巴胺的量呈良好的線性關(guān)系，據(jù)此建立了一種直接、靈敏、選擇性好的測定多巴胺的方法。在最佳條件下，多巴胺的其線性范圍為0.02～20.0

1 引 言

多巴胺（DA）是一種重要的神經(jīng)信息傳遞物質(zhì)，腦內(nèi)多巴胺的釋放和吸收與精神分裂癥和帕金森氏癥密切相關(guān)[1]。因此，建立快速、靈敏、高選擇、可靠的多巴胺分析方法對于神經(jīng)生理學研究、疾病診斷及相關(guān)藥物的質(zhì)量控制均有重要意義。目前，測定多巴胺的方法有電化學法[2～4]、色譜法[5，6]和光譜法[7，8]，這些方法中雖然有的靈敏度較佳、選擇性較好和操作較簡易，但是仍然不能滿足目前要求高選擇、高靈敏和快速的檢測方式，限制了其使用范圍，對于多巴胺的檢測仍是一種挑戰(zhàn)。

量子點是一種發(fā)光納米顆粒，與傳統(tǒng)的有機熒光染料相比， 量子點具有熒光量子產(chǎn)率高、光化學穩(wěn)定性好等優(yōu)良特性， 是一種很有發(fā)展?jié)摿Φ臒晒馓结?。近年來?量子點廣泛應(yīng)用于生物成像[9]、生物標記[10]。同時，基于量子點的熒光增強或猝滅效應(yīng)， 量子點還應(yīng)用于重金屬離子的檢測[11]和藥物含量的測定[12]。

本研究采用二硫基琥珀酰亞胺丙酸酯（DSP），4-巰基苯硼酸（MBA）中的巰基與CdTe量子點相結(jié)合，DSP與MBA對CdTe進行功能化（MBA-DSP-CdTe QDs），不僅能起到穩(wěn)定CdTe的作用，同時它們能與多巴胺作用，具有雙分子識別多巴胺的作用，多巴胺引起功能化探針聚合，使得探針熒光發(fā)生猝滅。雙分子識別熒光猝滅法將雙分子識別的選擇性[13，14]和熒光猝滅法的高靈敏度[15，16]結(jié)合，抗壞血酸與尿酸無需分離，對測定結(jié)果無影響。本方法采用量子點為發(fā)光源，多巴胺導致量子點聚集，引起量子點熒光猝滅，可直接測定多巴胺，據(jù)此建立了一種測定多巴胺的新方法。

2 實驗方法

2.1 儀器與試劑

F-4500型熒光光度計 （日本島津公司）； pHS-3C精密pH計 （上海雷磁儀器廠）；SYZ-550型石英亞沸高純水蒸餾器 （江蘇金壇醫(yī)療器械廠），JEM-1230透射電子顯微鏡（日本），PHI-5000C ESCA X-射線光電子能譜分析儀（美國PHI公司）。

CdCl2#8226;2.5H2O （AR，上?；瘜W試劑公司）；碲粉，二硫基琥珀酰亞胺丙酸酯 （DSP）、4-巰基苯硼酸 （MBA） （AR，中國醫(yī)藥化學試劑公司）；硼氫化鈉（AR，天津環(huán)威精細化工有限公司）；PBS緩沖溶液：分別準確稱取17. 91 g Na2HPO4#8226;12H2O和7. 80 g NaH2PO4#8226;2H2O溶于水中，定容至100 mL， 調(diào)整兩種溶液的混合比， 可得到不同pH值的PBS緩沖溶液；所有試劑純度至少為分析純，實驗用水為二次去離子水。

2.2 MBA-DSP-CdTe QDs的制備

將0.0694 g CdCl2#8226;2.5H2O 溶解在100 mL 超純水中，磁力攪拌除氧30 min后加入20

10支，將藥液混合均勻后準確移取1 mL置于100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。準確移取上述溶液1 mL于10 mL比色管中，加入0.4 mL MBA-DSP-CdTe QDs，用pH 7.4 PBS緩沖液稀釋至刻度，搖勻后，待測。

2.4.2 血清處理 采用本方法直接測定血清樣品，測定結(jié)果偏差稍大；將血清進行處理后，測定結(jié)果理想。血清處理方法：吸取血清1.0 mL，加酸性正丁醇4.0 mL，超聲波處理3 min，2000 r/min離心5 min，準確取上清液3.0 mL，加入正己烷3.0 mL和0.1 mol/L HCl 0.5 mL于帶塞離心管中，超聲3 min后，以3000 r/min離心5 min， 多巴胺被萃取到下層水相中，同時作試劑空白試驗。

2.4.3 尿液處理

尿樣無需分離，可直接進行測定。取1.0 mL正常人尿樣， 加入5.0 mL pH 7.0 PBS， 稀釋至10.0 mL， 按實驗方法進行測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 MBA-DSP-CdTe QDs探針的X-射線光電子能譜和透射電鏡

對于MBA-DSP-CdTe QDs探針的X-射線光電子能譜見圖2。約在163.9 eV出現(xiàn)S2p峰，在400.9 eV處出現(xiàn)了N1s峰，在191.3 eV附近有B1s峰。結(jié)果表明，MBA和DSP成功連接到CdTe量子點。

采用透射電鏡表征制備的MBA-DSP-CdTe QDs探針及加入多巴胺后的探針（圖3），制備的探針呈球形，顆粒均勻，且呈現(xiàn)良好的分散性，粒徑約為2.9 nm；當向探針中加入多巴胺，多巴胺引起探針的聚集，形成的顆粒越來越大，且形狀不規(guī)則。

3.3 pH值的影響

在鄰苯二甲酸氫鉀-氫氧化鈉、醋酸-醋酸鈉、磷酸氫二鈉-檸檬酸、PBS緩沖介質(zhì)中進行測定。結(jié)果表明，PBS緩沖溶液最適宜。探針熒光強度變化的適宜酸度范圍為pH 5.5～8. 0。 pH＝7.4時，熒光強度強且與生物體液中酸度基本一致，適宜用量為1.2～1.8 mL。因此在后續(xù)實驗中選擇1.5 mL pH 7.4的PBS緩沖溶液維持體系酸度。

3.4 MBA-DSP-CdTe QDs用量的影響

MBA-DSP- CdTe QDs作為熒光探針，其用量對熒光強度有很大影響，濃度過低，其熒光信號低，但濃度過高則會導致噪音急劇增大，信號值不穩(wěn)定，靈敏度降低，所以需選擇合適的MBA-DSP-CdTe QDs用量。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著MBA-DSP-CdTe QDs用量的增大，體系的化學發(fā)光強度相應(yīng)增高，當MBA-DSP- CdTe QDs溶液用量為0.4 mL時，熒光猝滅值最大，且多巴胺對發(fā)光強度的抑制效應(yīng)最大。

3.5 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

為了考察探針的使用壽命，將制備好的探針在4 ℃冰箱中存放，利用該探針分別在7，30，60和120 d進行對多巴胺進行測定，測定結(jié)果的相對偏差分別為3.8%，4.1%，3.5%和5.2%，結(jié)果表明該探針至少在120 d內(nèi)，能夠使用，且測定結(jié)果良好。為了研究制備的探針的重現(xiàn)性，對該探針分別用于4種濃度（0.5，1.0，5.0和10.0

References

1 Roitman M F， Stuber G D， Phillips P E M， Wightman R M， Carelli R M. J. Neuroscience， 2004， 24: 1265～1271

2 WANG Chun-Yan， TANG Xiao-Feng， TIAN Jian， YOU Tian-Yan（王春燕， 唐小風， 田 間， 由天艷）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2009， 37（12）: 1800～1804 

3 YAO Hong， SUN Yuan-Yuan， LIN Xin-Hua， HUANG Li-Ying， LI Guang-Wen（姚 宏， 孫媛媛， 林新華， 黃麗英， 李光文）. Journal of Analytical Science（分析科學學報）， 2007， 23（6）: 673～676

4 LI Wei-Juan， LUO Shi-Zhong（李衛(wèi)娟， 羅世忠）. Journal of Instrumental Analysis（分析測試學報）， 2009， 28（11）: 1287～1290

5 Abdolkarim A， Ali G. Anal. Chem.， 2009， 81（9）: 3660～3664

6 Chen C P， Jong H H. Anal. Chem.， 2007， 79（18）: 7182～7186

7 LI Li-Jun， ZHONG Zhao-Heng， FENG Jun， CHEN Qi-Feng， CHENG Hao， HUANG Wen-Yi， KONG Hong-Xing， WU Jian-Ling（李利軍， 鐘招亨， 馮 軍， 陳其鋒， 程 昊， 黃文藝， 孔紅星， 吳健玲）. Journal of Instrumental Analysis（分析測試學報）， 2007， 26（1）: 125～127

8 WANG Yan， LONG Yun-Fei， HUANG Cheng-Zhi， LI Yuan-Fang（王 燚， 龍云飛， 黃承志， 李原芳）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2007， 35（12）: 1741～1744

9 Betty Y S K， Wen J， John O， Christopher M Y， James T R， Warren C W C， Nano Lett.， 2008， 8（11）: 3887～3892

10 Dan Z， Chan W H， He Z， Ting Q， Anal. Chem.， 2009， 81： 3537～3543

11 Wang C， Zhao J W， Yan W，Nan L， Qiang M， Su X G． Sensors and Actuators B， 2009， 139: 476～482

12 Qu F G， Zhou X F， Xu J， Li H B， Xie G Y， Talanta， 2009， 78: 1359～1363

13 MA Ceng-Yan， LI Jiang-Yuan， XIANG Wei（馬曾燕， 李將淵， 向 偉）. Chinese J. Appl. Chem.（應(yīng)用化學）， 2009， 26（2）: 224～228

14 SUN Deng-Ming， CHEN Gao-Li， MA Wei（孫登明， 陳高禮， 馬 偉）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2009， 37（7）: 999～1003

15 SUN Deng-Ming， TIAN Xiang-Xing， MA Wei（孫登明， 田相星， 馬 偉）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2010， 38（12）: 1742～1746

16 HE Xiao-Ying， JIANG Xiao-Li， LI Rong， ZHANG Yan（何曉英， 蔣曉麗， 李 容， 張 艷）. Journal of Instrumental Analysis（分析測試學報）：2009， 28（7）: 819～823

17 CHEN Zhi-Bing， CHEN Yu， XU Ji-Gui， ZHANG Jun-Jun， ZHANG Li（陳志兵， 陳 玉， 徐基貴， 張俊俊， 張 莉）. Chinese Journal of Analysis Laboratory（分析試驗室）: 2010， 29（12）: 5～7

Fluorescence Quenching Method for Determination of Dopamine

Based on Double Molecular Recognition

YAN Mei， GE Shen-Guang， LU Juan-Juan， YU Jing-Hua*

（Shandong Provincial Key Laboratory of Fluorine Chemistry and Chemical Materials，

School of Chemistry and Chemical Engineering， University of Jinan， Jinan 250022）



Abstract CdTe quantum dots probe with both 4-mercaptophenylboronic acid and dithiobis（succinimidylpropionate） was designed and functionalized， and characterized by XPS and TEM. Emission spectra of CdTe quantum dots probe and dopamine was scanned under 431 nm excitation wavelength. The maximum emission wavelength shift red. At the maximum emission wavelength， dopamine results in fluorescence quenching of the probe. A direct， selective， and sensitive strategy for the determination of dopamine was established. The effects of determination conditions were investigated. Under the optimal conditions， a good linearity （R2＝0.987） was obtained between fluorescence intensity and dopamine concentration in the range of 0.02－20.0