QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定土壤中5種常用除草劑

摘 要 建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）簡單、快速、靈敏、準確地同時測定土壤中5種常用除草劑多殘留量的方法。樣品經(jīng)改進的QuEChERS（快速、簡單、廉價、高效、靈活和安全）方法一步完成萃取凈化，未使用緩沖鹽溶液，經(jīng)乙腈萃取，N-丙基乙二胺（PSA）和C18吸附劑填料凈化，離心后直接過膜上機檢測，萃取和凈化的效果滿足檢測要求。UPLC-MS/MS 方法采用Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18（50 mm×2.1 mm i.d.， 1.7 色譜柱，柱溫30 ℃，流動相為甲醇和水，梯度洗脫，流速0.25 mL/min，電噴霧電離源正離子（ESI＋）多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式檢測，外標(biāo)法定量。5種常用除草劑在0.5～200

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法; 除草劑; 多種殘留； 土壤; QuEChERS方法

1 引 言

除草劑是土壤中環(huán)境激素類物質(zhì)的主要來源之一。目前，被廣泛使用的除草劑，如莠去津、異丙甲草胺、環(huán)嗪酮，它們的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，既具有較強的親脂性，能持久存在于土壤環(huán)境中，破壞土壤結(jié)構(gòu)，阻礙或抑制土壤微生物和植物的生命活動；也具有較強的水溶性，可以通過滲透和降水的淋洗作用污染地表水體系。另外，除草劑還可以通過食物鏈累積放大，致使生物體天然激素分泌失調(diào)，導(dǎo)致病變，危害人類健康。因此，除草劑對環(huán)境和人類健康造成的危害備受關(guān)注。

目前，除草劑在土壤中的殘留檢測方法包括氣相色譜法[1，2]、高效液相色譜法[3]及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4～6]及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法[7～11]。本研究將超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 （UPLC-MS/MS）應(yīng)用于除草劑多殘留痕量快速分析（3 min內(nèi)完成一個樣品多殘留檢測，比傳統(tǒng)方法快5～10倍）；具有靈敏度高、確證性強（多反應(yīng)監(jiān)測模式，即MRM方式）、抗干擾能力強（通過單通道掃描檢測，對前處理要求較低）等優(yōu)勢。

近幾年， 農(nóng)藥殘留分析的樣品前處理趨于簡單化和環(huán)境友好，目前應(yīng)用較廣的土壤前處理方法有固相萃?。⊿PE）[11，12]，加速溶劑萃?。ˋSE）[13]，微波輔助萃?。∕AE）[14]和超聲波輔助萃?。║SE）[8]。這些方法取代了傳統(tǒng)的耗費大量時間和溶劑的索式萃取法，但是需要較昂貴的萃取儀器，且通常需要后續(xù)的較繁瑣的凈化步驟，有的萃取過程還需要在高溫下進行。QuEChERS方法[15，16]是一種快速、簡單、廉價、高效、耐用、安全的樣品前處理方法，在食品安全領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[17]，而在土壤中的應(yīng)用少見報道。

本研究將改進的QuEChERS方法應(yīng)用于土壤樣品前處理。為了防止緩沖鹽對質(zhì)譜測定的干擾，樣品前處理過程未使用緩沖溶液，考察了不同吸附劑的凈化效果，同時簡化了前處理步驟，萃取后直接在萃取懸浮液中加入吸附劑， 一步完成土壤樣品的萃取和凈化，無需多步離心，且提取液無需濃縮，直接進行UPLC-MS/MS分析，在3 min內(nèi)即可完成土壤中莠去津、苯噻酰草胺、甜菜寧、異丙甲草胺和環(huán)嗪酮5種除草劑的殘留量定性與定量檢測。方法簡便、快速、準確、靈敏，能滿足土壤中殘留限量要求及農(nóng)殘檢測確證要求。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

ACQUITYTM 超高效液相色譜儀（Waters公司）；Micromass-Quattro Premier XE三重四極桿質(zhì)譜儀，配有ESI電離源（Waters公司）；Micromass Quattro premier、MassLynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Waters公司）；離心機（AllegraTM X-22R型，Beckman公司）；Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）；0.22

移液器（法國Gilson公司）；甲醇、乙腈（HPLC級，美國Fisher公司）；甲酸（HPLC級，美國Tedia公司）。農(nóng)殘級無水MgSO4及吸附劑填料N-丙基乙二胺（PSA），石墨化碳黑（GCB），C18均購自天津Agela公司。

莠去津、苯噻酰草胺、甜菜寧、異丙甲草胺和環(huán)嗪酮5種除草劑標(biāo)準品（純度＞98%， 北京化工大學(xué)標(biāo)準物質(zhì)研究所）。用甲醇將標(biāo)準品配制成濃度為1000 mg/L的單標(biāo)標(biāo)準儲備液，再將單標(biāo)標(biāo)準儲備液用稀釋配制成混標(biāo)儲備液（甜菜寧為2 mg/L，其它4種除草劑均為0.5 mg/L），實驗時以初始流動相將混合標(biāo)準儲備液配制成不同濃度的標(biāo)準工作液。

2.2 前處理方法

2.2.1 土壤樣品的制備 土壤樣品經(jīng)自然風(fēng)干，過1 mm篩后，室溫下保存?zhèn)溆?。樣品檢測結(jié)果顯示未殘留待測除草劑，可以作為空白土壤樣品。準確稱取1 g過篩土壤樣品，加入到15 mL離心試管中，加入適量混合標(biāo)準溶液以達到所需的添加水平。加標(biāo)后，甲醇溶液液面微高于土壤樣品，使除草劑在土壤中徹底混勻。萃取前，將加標(biāo)土壤樣品敞口置于通風(fēng)櫥中24 h， 以揮干溶劑和老化樣品。

2.2.2 QuEChERS一步萃取凈化方法 準確稱取1.0 g加標(biāo)土壤樣品，置于15 mL塑料離心管中，加入0.5 mL水浸潤20 min，加入4 mL乙腈，渦旋萃取2 min，加入0.1 g無水MgSO4，渦旋20 s，加入0.1 g PSA（或0.1 g PSA＋0.1 g C18，或0.1 g PSA＋0.03 g GCB）吸附劑，渦旋2 min，以10000 r/min高速離心3 min，取上清液直接過膜上機檢測。

2.3 分析條件

2.3.1 超高效液相色譜條件 Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm i.d.， 1.7

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇

分別采用甲醇-水和乙腈-水為流動相，在甲醇-水流動相中，5種除草劑的靈敏度均高于乙腈-水流動相，這主要是因為在ESI電離源-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)中，目標(biāo)物在甲醇中的離子化效率高，分析靈敏度較高。本實驗采用甲醇-水流動相，優(yōu)化的最佳色譜條件見2.3.1節(jié)，在3 min內(nèi)完成了5種除草劑的分離檢測，分離度好，峰形尖銳（圖1），各物質(zhì)的保留時間見表1。

3.2 質(zhì)譜條件的選擇

在ESI＋模式下，對5種除草劑農(nóng)藥的質(zhì)譜條件進行了優(yōu)化，分別采用全掃描和子離子掃描方式優(yōu)化得到了母離子、子離子及各自的最佳萃取錐孔電壓和碰撞能量，以響應(yīng)值最大的碎片離子（子離子）為定量離子，次級響應(yīng)離子為定性離子，從而得到了最優(yōu)質(zhì)譜條件（表1）。圖1A為MRM模式下5種除草劑的定量離子對的單通道掃描質(zhì)譜圖，各物質(zhì)的峰形尖銳，靈敏度高，確證性強。

3.3 改進的QuEChERS一步萃取凈化樣品前處理方法

3.3.1 QuEChERS前處理步驟的簡化 QuEChERS方法多應(yīng)用于蔬菜、水果和肉類等食品中，多采用緩沖溶液調(diào)節(jié)樣品的pH值，以保持目標(biāo)化合物的穩(wěn)定和萃取效率。由于食品樣品本身含有大量水分，緩沖鹽的存在顯著降低了目標(biāo)物在液質(zhì)聯(lián)用測定時的離子化效率，所以在前處理過程中必須進行除鹽。土壤樣品含水量少，pH多為中性，且相對穩(wěn)定，因此本研究采用無緩沖溶液的QuEChERS方法，可以省去除鹽步驟，適合直接進行液質(zhì)聯(lián)用分析。

本研究還對萃取凈化的前處理步驟進行了簡化，分別考察了土壤樣品前處理方法1和經(jīng)改進簡化了操作步驟的方法2。在方法1中，土壤樣品經(jīng)乙腈萃取，并加入無水MgSO4吸水后，需將萃取液高速離心，取出上清液； 向上清液中加入無水MgSO4和吸附劑進行凈化，然后再次高速離心，取上清液檢測。改進的QuEChERS方法2是將土壤樣品萃取后直接在萃取懸浮液中，加入無水MgSO4和吸附劑進行凈化，萃取和凈化一步完成，且步驟中只需經(jīng)一次高速離心即可取上清液檢測。實驗表明，方法1和方法2的5種除草劑的回收率均較好，無明顯區(qū)別（圖2），因此這兩種方法均可以采用，為使實驗操作更簡單、快速，在后續(xù)實驗中采用改進的一步萃取凈化的QuEChERS方法2。

3.3.2 吸附劑的選擇 吸附劑對回收率的影響既因為吸附劑對分析物的吸附作用，又由于吸附劑對雜質(zhì)的吸附凈化效果可能導(dǎo)致的基質(zhì)效應(yīng)，影響分析物在ESI電離源質(zhì)譜中的響應(yīng)值。吸附劑的選擇取決于樣品萃取物中的脂肪或者色素等雜質(zhì)的含量：（1）如果樣品中脂肪含量大于5%，吸附劑中需包含PSA和C18；（2）如果脂肪含量小于5%，而且萃取物中只含有少量色素或不含色素，吸附劑選用PSA即可；（3）如果脂肪含量小于5%，而且萃取物中含有大量色素，吸附劑中需包含PSA和GCB。土壤樣品中存在色素、脂肪、甾醇等雜質(zhì)，為選擇合適的吸附劑，比較了3種不同的吸附劑凈化的樣品回收率。

在進行了萃取步驟后（2.2.2節(jié)），分別加入不同的吸附劑： 0.1 g PSA（或0.1 g PSA＋0.1 g C18，或0.1 g PSA＋0.03 g GCB）進行凈化，回收結(jié)果見圖3。由圖3可見，PSA＋C18吸附劑的回收率最高，說明該吸附劑對分析物吸附作用較小，同時對色素、脂肪、甾醇等雜質(zhì)的凈化效果較好，因此選擇PSA＋C18作為吸附劑。圖1B由上至下依次為5種除草劑的標(biāo)準品質(zhì)譜圖；經(jīng)0.1 g PSA＋0.1 g C18吸附劑填料按2.2.2節(jié)方法處理的加標(biāo)樣品和空白土壤樣品質(zhì)譜圖，可以看到空白土壤背景值干凈，加標(biāo)樣品的分離度和峰形均較好，可以進行定性定量檢測，圖1A為定量離子對的MRM質(zhì)譜圖。

References

1 HE Min， JIA Chun-Hong， YU Ping-Zhong， CHEN Li， ZHU Xiao-Dan， ZHAO Er-Cheng （賀 敏， 賈春虹， 余平中， 陳 莉， 朱曉丹， 趙爾成）. Agrochemicals（農(nóng)藥）， 2009， 48（12）: 902～903

2 Pinto C G， Laespada M E F， Martín S H， Ferreira A M C， Pavón J L P， Cordero B M. Talanta， 2010， 81（1-2）: 385～391

3 ZHANG Liang， SUN Jian-Ning， XIONG Xian-Gui， JIA Hui-Xian （張 亮， 孫劍寧， 熊先貴， 賈慧嫻）. Chinese Journal of Analysis Laboratory （分析試驗室）， 2010， 29（12）: 84～86

4 Lesueur C， Gartner M， Mentler A， Fuerhacker M. Talanta， 2008， 75（1）: 284～293



5 GUI Jian-Ye， ZHANG Li， LIU Ji-Hua， ZHANG Yong-Tao， ZHUO Hai-Ying， LI Xiao-Ya， ZHANG Lin， LI Gui-Xiang（桂建業(yè)， 張 莉， 劉繼華， 張永濤， 左海英， 李小亞， 張 琳， 李桂香）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學(xué)）， 2010， 389（8）: 1177～1181

6 Rashid A， Nawaz S， Barker H， Ahmad I， Ashraf M. J. Chromatogr. A， 2010， 1217（17）: 2933～2939

7 Maía Ibez， scar J. Pozo， Juan V. Sancho， Francisco J. López， Hernndez F. J. Chromatogr. A， 2005， 1081（11）: 145～155

8 NIN Zeng-Yuan， LUO Xin， TANG Zhi-Xu， YE Xi-Wen， SUN Yin-Feng， ZHANG Hong-Wei， WANG Feng-Mei （牛增元， 羅 忻， 湯志旭， 葉曦雯， 孫銀峰， 張鴻偉， 王鳳美）. Chinese J. Anal. Chem. （分析化學(xué)）， 2009， 37（4）: 505～510

9 HU Kai-Feng， SUN Tao， LIU Sheng-Hong， QIAO Kun-Yun （胡開峰， 孫 濤， 劉圣紅， 喬坤云）. Journal of Instrumental Analysis （分析測試學(xué)報）， 2010， 29（11）: 1216～1220

10 LIU Jin-Xia， ZHANG Ying， DING Li， LIU Xiao-Xia， HUANG Zhi-Qiang， CHEN Bo， WANG Li-Bing（劉錦霞， 張 瑩， 丁 利， 劉曉霞， 黃志強， 陳 波， 王利兵）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學(xué)）， 2011， 39（5）: 664～669

11 YE Gui-Biao， ZHANG Wei， CUI Xin， PAN Can-Ping， JIANG Shu-Ren（葉貴標(biāo)， 張 微， 崔 昕， 潘燦平， 江樹人）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學(xué)）， 2006， 34（9）: 1207～1212

12 Ozcan S， Tor A， Aydin M E. Anal. Chim. Acta， 2009， 640（1）: 52～57

13 Dagnac T， Bristeau S， Jeannot R， Mouvet C， Baran N. J. Chromatogr. A， 2005， 1067（1）: 225～233

14 Papadakis E N， Vryzas Z， Papadopoulou-Mourkidou E. J. Chromatogr. A， 2006， 1127（2）: 6～11

15 Foods of Plant Origin， Determination of Pesticide Residues Using GC–MS and/or LC-MS/MS Following Acetonitrile Extraction/Partitioning and Clean-up by Dispersive SPE， QuEChERS-Method， CEN Standard Method EN 15662， European Committee for Standardization Standard Method.

16 Pesticide Residues in Foods by Acetonitrile Extraction and Partitioning with Magnesium Sulphate-Gas Chromatography/Mass Spectrometry and Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry， AOAC Official Method 2007.01， 18th ed.， Official Methods of Analysis of AOAC International， 2007

17 GONG Xiao-Ming， DONG Jing， SUN Jun， YU Jin-Ling， PAN Shou-Qi， WANG Hong-Tao， DING Kui-Ying （宮小明， 董 靜， 孫 軍， 于金玲， 潘守奇， 王洪濤， 丁葵英）. Journal of Instrumental Analysis （分析測試學(xué)報）， 2010， 29（9）: 933～937

QuEChERS-Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass

Spectrometry for Determination of 5 Currently Used Herbicides

MEI Mei， DU Zhen-Xia*， CHEN Yun

（College of Science， Beijing University of Chemical Technology， Beijing 100029）



Abstract A simple， rapid sensitive and accurate ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method was developed for the simultaneous determination of five currently used herbicides in soil. The sample preparation using the modified QuEChERS （quick， easy， cheap， effective， rigged， and safe） method completed the extraction and clean-up steps in one procedure. In this none buffer QuEChERS method， samples were extracted with acetonitrile， cleaned up with primary secondary amine （PSA） and C18 sorbent， then centrifugated and filtrated before detection. The pretreatment method was simple， rapid and effective and can meet the detection requirements. The UPLC-MS/MS method was performed on Waters ACQUITY UPLCTM BEH Ｃ18 （50 mm×2.1 mm i.d.， 1.7

SymbolmA@ m） and the column temperature was 30 ℃， the gradient elution with methanol and pure water as the mobile phase and the flow rate was 0.25 mL/min. The positive electrospray ionization （ESI＋） source under the multiple reaction monitoring （MRM） mode and external standard method were used for quantification. The results showed that the correlation coefficients up to 0.9984 were obtained across a concentration range of 0.5－200