金納米顆粒作為Cu2+氧化半胱氨酸的可視化指示劑及其應(yīng)用

摘 要 Cu2＋能選擇性氧化半胱氨酸，破壞半胱氨酸與金納米顆粒之間金硫鍵的形成，阻止半胱氨酸導(dǎo)致的金納米顆粒聚集。因而，金納米顆?？勺鳛镃u2＋氧化半胱氨酸的可視化指示劑，本實(shí)驗(yàn)據(jù)此建立了高選擇性檢測(cè)Cu2＋的色度分析方法。在HClNaAc緩沖體系（pH 3.6）中，金納米顆粒在525 nm處的吸光度值與Cu2＋的濃度在8.0×10－8～2.0×10－6 mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9962; 檢出限 （3σ/k） 為1.5×10－9 mol/L。將本方法用于天然水體中Cu2＋的測(cè)定，具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。

關(guān)鍵詞 金納米顆粒；Cu2＋；比色檢測(cè)；半胱氨酸

1 引 言

Cu2＋是人體必須的微量元素之一，在人體內(nèi)保持著一種特殊的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。Cu2＋缺乏時(shí)，會(huì)引起關(guān)節(jié)炎、血管損傷、冠心病及Menkes等疾??；而Cu2＋過(guò)量時(shí)，則會(huì)誘發(fā)胃腸炎、癌癥、肝硬化、Wilson病[1]。目前，測(cè)定Cu2＋的方法主要有電化學(xué)分析法[2～4]、熒光分析法[5～7]、原子吸收光譜法［8，9］、光散射法[10]等。上述分析方法操作繁瑣[4，5]，熒光試劑易漂白[6]，有機(jī)小分子的合成較為耗時(shí)[10]。胡明明等合成了一種羅丹明B衍生物用作Cu2＋的探針， 實(shí)現(xiàn)環(huán)境水樣中Cu的可視化檢測(cè)［11］。隨著納米分析技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)建立了一系列基于金屬納米顆粒特征光譜性質(zhì)的Cu2＋分析法。如利用半胱氨酸功能化負(fù)電金納米顆粒，在Cu2＋存在下，因半胱氨酸的羧基和氨基與Cu2＋形成2∶1絡(luò)合物，誘導(dǎo)金納米顆粒聚集，據(jù)此檢測(cè)10－5 mol/L Cu2＋和半胱氨酸[3，12，13]（圖1a）。在這個(gè)作用過(guò)程中，金納米顆粒首先需要半胱氨酸巰基功能化，然后再利用Cu2＋與半胱氨酸的羧基和氨基發(fā)生配位作用。Cu2＋的分析是二步法，較為復(fù)雜。在這個(gè)過(guò)程中，Cu2＋也可與半胱氨酸上沒有與金納米顆粒作用的[TS（] 圖1 金納米顆粒檢測(cè)Cu2＋示意圖

Fig．1 Schematic illustration of colorimetric determination of Cu2＋based on gold nanopanticles （AuNPs）[TS）]游離巰基發(fā)生氧化還原作用[14，15]。

與文獻(xiàn)的兩步法不同的是，本實(shí)驗(yàn)采用如圖1b所示的一步法，即以半胱氨酸和金納米顆?；旌弦簽閰⒖急尘?，充分利用Cu2＋與半胱氨酸巰基之間的氧化還原作用，以表面等離子體共振吸收作為測(cè)定參數(shù)檢測(cè)水環(huán)境中Cu2＋。本方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，選擇性好。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

UV3600 紫外可見分光光度計(jì)、F4500熒光分光光度計(jì)、S4800掃描電子顯微鏡（日本日立公司）；pHS3C 型酸度計(jì)（成都方舟科技開發(fā)公司）；QL901漩渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；HH2數(shù)顯恒溫水浴鍋（江西省榮華儀器制造有限公司）；ZetasizerNanoZS（馬爾文儀器有限公司）。

2.0 mmol/L 氯金酸溶液（HAuCl4， 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）; 0.01 mol/L NaBH4，0.20 mol/L十六烷基三甲基溴化銨（CTMAB），均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；0.10 mol/L抗壞血酸（LAA，重慶川東化工集團(tuán)有限公司化學(xué)試劑廠）; 1.0×10－5 mol/L CuCl2（天津市河北區(qū)海晶精細(xì)化工廠），1.0×10－4 mol/L 半胱氨酸（LCys，成都市科龍化學(xué)試劑廠）置于4℃冰箱避光保存，使用 pH 3.6鹽酸醋酸鈉（HClNaAc）緩沖液控制酸度。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水，試劑均為分析純。

2.2 金納米粒子的制備

采用晶種生長(zhǎng)法[16]制備金納米顆粒，用6.0×10－3 mol/L新制的冰凍NaBH4溶液在7.5×10－2 mol/L CTMAB溶液中還原2.5×10－4 mol/L HAuCl4溶液，劇烈混勻約30 s后，置于29 ℃恒溫水浴鍋中靜置2 h。在含有1.0 mL 2.0×10－3 mol/L HAuCl4和7.1 mL H2O 的生長(zhǎng)液中加入0.80 mL 1.6×10－3 mol/L CTMAB，溶液迅速由淺黃色變成橙色，加入0.6 mL 6.0 mmol/L LAA，搖勻，溶液立即變?yōu)闊o(wú)色。加入0.5 mL上述已靜置2 h的金種，搖勻，溶液顏色逐漸變紅。將溶液放置于29 ℃恒溫水浴鍋中靜置24 h，形成粒徑約為25 nm的金納米顆粒。金納米顆粒的濃度為2.0×10－4 mol/L（按照金原子的濃度來(lái)計(jì)算）。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

在1.5 mL EP管中加入適量1.0×10－5 mol/L CuCl2溶液，0.10 mL 1.0×10－4 mol/L LCys溶液，在50 ℃水浴中反應(yīng) 5 min，加入0.075 mL HClNaAc緩沖溶液（pH 3.6），用二次蒸餾水定容至0.45 mL，再加入0.30 mL 2.0×10－4 mol/L金納米顆粒，每加入一種溶液后均搖勻；在50 ℃水浴中反應(yīng)15 min。在UV3600紫外可見分光光度計(jì)上掃描測(cè)得吸收光譜，波長(zhǎng)范圍為400～800 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 光譜特征

粒徑為25 nm 單獨(dú)金納米顆粒（AuNPs）在525 nm處有一特征等離子體共振吸收峰（圖2a），當(dāng)加入LCys后，AuNPs和LCys之間形成AuS，LCys的羧基和氨基通過(guò)氫鍵作用，誘導(dǎo)AuNPs發(fā)生聚集[17～19]，表現(xiàn)為在700 nm處有一新峰出現(xiàn)，而525 nm處的吸收峰強(qiáng)度降低。但在有Cu2＋存在的介質(zhì)中，700 nm處的吸收峰強(qiáng)度隨Cu2＋濃度的增大而逐漸降低，直至消失。而525 nm 吸收峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，且與Cu2＋濃度呈良好的線性關(guān)系。其原因是Cu2＋與LCys之間先發(fā)生了氧化還原作用，使得LCys的巰基不再與AuNPs作用形成AuS，導(dǎo)致越來(lái)越多的AuNPs處于分散狀態(tài)。

從體系的散射光譜（圖2b）可知，單獨(dú)的AuNPs和AuNPsCu2＋ 溶液中納米顆粒都比較分散，等離子體共振散射強(qiáng)度相對(duì)較弱，而AuNPsCys溶液中納米顆粒呈聚集狀態(tài)，等離子體共振散射強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。但在有Cu2＋存在的介質(zhì)中，等離子體共振散射強(qiáng)度隨著加入的Cu2＋濃度的增大逐漸降低，這與吸收光譜的結(jié)果是一致的，其原因是AuNPs由聚集變得越來(lái)越分散。該結(jié)果還可以進(jìn)一步從掃描電子顯微鏡（SEM）圖得到證實(shí)。如圖3所示，在pH 3.6時(shí)， LCys形成兩性離子[17，20]，誘導(dǎo)AuNPs聚集（圖3a）；但當(dāng)LCys溶液先與一定量的Cu2＋反應(yīng)一段時(shí)間后，再加AuNPs，則AuNPs較分散，僅有少量AuNPs團(tuán)聚在一起（圖3b），實(shí)驗(yàn)結(jié)果與吸收和散射圖譜得出的。[TS（]圖2 Cu2＋存在下，AuNPs與Cys 作用的等離子體共振吸收光譜（a）和等離子體共振散射光譜（b）

Fig．2 Plasmon resonance absorption spectra （a） and plasmon resonance light scattering （PRLS） spectra （b） of reaction between AuNPs and Cys in the absence/presence of Cu2＋

1. AuNPsCys; 2～4. AuNPsCysCu2＋; 5. AuNPsCu2＋; 6. AuNPs. 9.3×10－5 mol/L AuNPs; 1.5×10－5 mol/L Cys; Cu2＋ （Curves 2～5，

其原因是強(qiáng)還原劑LCys將弱氧化劑Cu2＋還原成Cu＋，自身被氧化變成了胱氨酸，Cu＋與多余的LCys形成穩(wěn)定的絡(luò)合物[14，15]。半胱氨酸的巰基與AuNPs之間的AuS減少，導(dǎo)致AuNPs的聚集程度減弱; 隨著Cu2＋量的增加，AuNPs變得越來(lái)越分散。為了進(jìn)一步證實(shí)此作用機(jī)理，采用動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)測(cè)定Cu2＋和半胱氨酸作用前后金納米顆粒水和粒徑的變化（圖4）。結(jié)果表明，隨著Cu2＋濃度增大，AuNPs聚集體顆粒平均粒徑逐漸減小。

3.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化

圖5為L(zhǎng)Cys用量對(duì)體系吸收強(qiáng)度的影響。當(dāng)LCys濃度較小時(shí)，Cu2＋不能很好地阻止AuNPs聚集；而LCys濃度太大時(shí)，則需要較多的Cu2＋與其反應(yīng)，影響Cu2＋的檢測(cè)靈敏度；1.5×10－5 mol/L LCys可以使AuNPs完全聚集，Cu2＋檢測(cè)的靈敏度較高。本實(shí)驗(yàn)中LCys用量選擇1.5×10－5 mol/L。

LCys通過(guò)AuS結(jié)合在金膠表面。在pH≈4.0時(shí)，形成兩性離子，并通過(guò)靜電作用誘導(dǎo)AuNPs發(fā)生聚集[17，20]。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)溶液pH＞4.8或pH＜3.0時(shí)，Cu2＋與LCys的作用不強(qiáng)，阻止AuNPs發(fā)生聚集的能力較弱；當(dāng)pH＝3.6時(shí)，Cu2＋阻止AuNPs聚集的能力最強(qiáng)。故實(shí)驗(yàn)選擇pH 3.6。

實(shí)驗(yàn)表明，LCys與AuNPs作用的吸收強(qiáng)度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，15 min后基本保持不變，此時(shí)反應(yīng)基本達(dá)到穩(wěn)定。而加入Cu2＋溶液后，吸收強(qiáng)度隨時(shí)間無(wú)明顯變化，故將反應(yīng)時(shí)間固定為15 min。

隨著溫度的升高，巰基活性增強(qiáng)，加劇了AuNPs的聚集程度；但溫度過(guò)高巰基易被空氣中的氧氧化，不利于AuS的形成，導(dǎo)致AuNPs聚集程度降低。同時(shí)，隨著溫度的升高，Cu2＋與LCys作用能力增強(qiáng)，但不能完全破壞AuS形成。在50 ℃時(shí)，空白與樣品的吸收值相差最大，說(shuō)明該溫度下，Cu2＋阻止AuNPs聚集的能力最強(qiáng)，故反應(yīng)溫度選擇50 ℃。

3.3 方法的選擇性

如圖6所示，在該實(shí)驗(yàn)條件下，共存濃度為1.3×10－6 mol/L的常見13種金屬離子（Zn2＋， Mg2＋， Cd2＋， Co2＋， Al3＋， Ca2＋， Pb2＋， Fe3＋， Fe2＋， Ni2＋， Mn2＋， Li＋和Hg2＋）對(duì)Cu2＋測(cè)定基本無(wú)干擾。其中包括與巰基結(jié)合力較強(qiáng)的Hg2＋，這可能是由于巰基與AuNPs的作用力強(qiáng)于Hg2＋。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品分析

實(shí)驗(yàn)表明，金納米顆粒在525 nm處的吸光值強(qiáng)度與Cu2＋的濃度在8.0×10－8 ～2.0×10－6 mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為A＝0.125＋0.0508C，相關(guān)系數(shù)為0.9962; 檢出限為（3σ/k） 為1.5×10－9 mol/L。將本方法用于合成樣品中Cu2＋的測(cè)定，結(jié)果如表1所示。Cu2＋的回收率為95.0%～99.1%，RSD＜0.78%。為了驗(yàn)證方法的實(shí)用性，測(cè)定了來(lái)自嘉陵江、西南大學(xué)崇德湖和自來(lái)水等實(shí)際樣品中銅的含量。將江水和湖水過(guò)濾，自來(lái)水煮沸后冷卻過(guò)濾。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果如表2所示，回收率為92.8%～105.4%; RSD＜1.69%。說(shuō)明本方法具有較好的精密度和準(zhǔn)確度。

本實(shí)驗(yàn)利用Cu2＋和半胱氨酸的相互作用，阻止半胱氨酸誘導(dǎo)金納米顆粒聚集引起的表面等離子體共振吸收變化，建立了一種檢測(cè)水環(huán)境中Cu2＋高靈敏度和高選擇性比色分析方法。金納米顆粒是一種很好的Cu2＋氧化半胱氨酸的可視化指示劑。本方法簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)、靈敏度高。

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Gold Nanoparticles as a Visual Indicator for Redox Reaction Between

Copper Ion and Cysteine and Its Analytical Application

TANG Jie， WANG Jian， WANG Yi， LI YuanFang*

（Education Ministry Key Laboratory on Luminesence and RealTime Analysis，

College of Chemistry and Chemical Engineering， Southwest University， Chongqing 400715）



Abstract A colorimetric method for copper ion （Cu2＋） in aqueous solution is described on the basis of the oxidation of thiol group of cysteine by Cu2＋， which depends on the binding of cysteineAuNPs and with the damage of binding， the formation of gold nanoparticle aggregates would be restrained. Thereby AuNPs acts as the visualization indicator for the oxidation of cysteine by copper ions. In a medium of pH 3.6， a linear relationship has been obtained between the absorbance at 525 nm and the concentration of Cu2＋ in the range of 8.0×10－8－2.0×10－6 mol/L with the correlation coefficient （r） of 0.9962 and the detection limit （3σ/k） of 1.5×10－9 mol/L. The proposed method has been successfully applied to the analysis of synthetic mixtures and water samples.

Keywords Colorimetric detection; Copper ions; Gold nanoparticles; Lcysteine