副溶血性弧菌細(xì)胞猝滅及代謝物組提取方法的優(yōu)化

摘 要 以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）為分析方法，比較了液氮和75%甲醇（－80 ℃）兩種溶液對副溶血性弧菌細(xì)胞的猝滅效果，以及氯仿、75%冰甲醇、水、甲醇-氯仿-水（10∶3∶1， V/V）、甲醇-氯仿-水（3∶1∶1， V/V）、甲醇-氯仿（1∶1， V/V）6種提取劑對副溶血性弧菌代謝物組的提取效果。結(jié)果表明，用75%甲醇（－80 ℃）猝滅副溶血性弧菌時，出現(xiàn)了代謝物泄漏現(xiàn)象，而液氮猝滅則不存在這個現(xiàn)象；檢索發(fā)現(xiàn)，采用75%冰甲醇提取獲得了47種代謝物，峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.02%，其它5種提取劑獲得代謝物種類少于40種，且重現(xiàn)性差。比較色譜峰數(shù)量、面積和重現(xiàn)性后發(fā)現(xiàn)，液氮猝滅、75%冰甲醇提取適于副溶血性弧菌代謝物組提取。

關(guān)鍵詞 副溶血性弧菌； 猝滅方法； 代謝物組提取方法； 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

1 引 言

代謝組學(xué)通過定性與定量研究生物體內(nèi)代謝物的變化研究生物體代謝途徑，代謝組學(xué)主要關(guān)注分子量小于1000的小分子[1]。目前，代謝組學(xué)的研究已在藥物研發(fā)[2]、代謝成分研究、疾病檢測[3～5]、生物標(biāo)志物尋找[6]等方面展開。近幾年代謝組學(xué)在微生物研究中迅速展開，已對部分微生物代謝物提取方法進(jìn)行了優(yōu)化[7～9]，并研究了猝滅過程中的冷休克現(xiàn)象[10]。

副溶血性弧菌是一種常見的食源性致病菌，由該菌引起的食物中毒事件占細(xì)菌性食物中毒事件60%以上[11]。代謝組水平研究是副溶血性弧菌的致病機(jī)理的重要研究內(nèi)容。本研究對副溶血性弧菌細(xì)胞猝滅及代謝物組提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，為副溶血性弧菌代謝組學(xué)分析奠定了基礎(chǔ)。2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

5975B型質(zhì)譜、6890N型氣相色譜（美國Agilent公司）； JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Hermle Z36HK冷凍離心機(jī)（德國Hermle公司）；真空干燥機(jī)（美國Eppendorf公司）；1

2.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計檢驗(yàn)

本研究采用NIST、Origin 8.0、Past 1.79和SPSS 13.0對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)不同方法得到的色譜總離子圖中峰數(shù)量和峰面積判斷不同方法的優(yōu)劣。匹配度為樣品質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)圖譜的正檢索相似系數(shù)（0～1000），匹配度≥700為適合匹配度?？赡苄詾闃悠焚|(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)圖譜的正、反檢索相似系數(shù)的綜合，置信區(qū)間為≥80%。

3 結(jié)果與討論

3.1 細(xì)胞猝滅方法比較

比較75%甲醇（－80 ℃）與液氮兩種溶劑對副溶血性弧菌細(xì)胞的猝滅效果。用75%甲醇（－80 ℃）和液氮分別處理同一批樣品，用6種溶劑對代謝物進(jìn)行提取。由較圖1和表1可見，用液氮猝滅后，以75%冰甲醇提取，獲得峰數(shù)量最多。75%甲醇（－80 ℃）猝滅時，細(xì)胞出現(xiàn)代謝物泄漏（圖2和表2）。液氮猝滅速度快，不存在代謝物泄漏問題，且操作簡便，因此，液氮更適合于副溶血性弧菌猝滅。

3.2 代謝物組提取方法比較

由圖1可見，以75%冰甲醇為提取劑時，獲得的代謝物種類最多；以甲醇-氯仿-水（3∶1∶1， V/V）為提取劑時，所提取代謝物量最多，但重現(xiàn)性較差。計算6種提取溶劑3個平行中峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示，75%冰甲醇、氯仿、水、甲醇-氯仿-水（10∶3∶1， V/V）、甲醇-氯仿-水（3∶1∶1， V/V）和甲醇-氯仿（1∶1， V/V）的標(biāo)準(zhǔn)偏差依次為 8.02%， 4.79%， 27.00%， 71.33%， 13.10%和9.93%。6種提取溶劑的提取結(jié)果經(jīng)主成分分析（PCA）及聚類分析（CA）發(fā)現(xiàn)，甲醇-氯仿-水（3∶1∶1， V/V）提取所得代謝物種類與前5種差異較大（圖3）。對75%冰甲醇提取所得總離子圖分析，根據(jù)峰面積、峰數(shù)量、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差及物種數(shù)量，確定75%冰甲醇最適合于副溶血性弧菌代謝物組的提取（表3）。

3.3 方法穩(wěn)定性測定

樣品經(jīng)液氮猝滅、75%冰甲醇提取，衍生化后，進(jìn)行GC-MS分析，比較所得圖譜的峰數(shù)量及峰面積。結(jié)果顯示，所有共有峰保留時間重現(xiàn)性良好，幾乎所有峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，總峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.56%，說明此方法的穩(wěn)定性較好（圖4）。

3.4 放置時間對提取代謝物組的影響

樣品經(jīng)液氮猝滅、75%冰甲醇提取的代謝物組衍生化后，在－20 ℃放置48 h。對放置前后樣品進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，峰數(shù)量未發(fā)生變化，單個峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，總峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.84%。結(jié)果表明，放置前后樣品未發(fā)生明顯變化。

4 結(jié) 論

以GC-MS為代謝組分析方法，對副溶血性弧菌細(xì)胞猝滅及代謝物組提取方法進(jìn)行優(yōu)化。用NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫快速檢索代謝物，發(fā)現(xiàn)75%甲醇（－80 ℃）猝滅過程中磷酸、棕櫚酸和丙三醇等出現(xiàn)泄漏。比較6種提取劑提取所得總離子圖發(fā)現(xiàn)，75%冰甲醇獲得峰數(shù)量最多，重現(xiàn)性較好。液氮猝滅，75%冰甲醇提取，適用于副溶血性弧菌代謝物組，為副溶血性弧菌代謝組學(xué)分析奠定了良好基礎(chǔ)。

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Comparison of Quenching and Extraction Methods for Metabolome

Analysis of Vibrio Parahaemolyticus

ZHAO Qiang， LIU Hai-Quan， LU Ying， SUN Xiao-Hong， PAN Ying-Jie， ZHAO Yong*

（Shanghai Ocean University， College of Food Science ＆Technology， Shanghai 201306）

Abstract A reliable cell quenching and metabolite extraction method was crucial for microbial metabolism analysis. For metabolism analysis of Vibrio parahaemolyticus， liquid nitrogen and 75% methanol （－80 ℃） were compared for their efficiency of cell quenching， and six different extraction solvents based on （i） chloroform， （ii） 75% cold methanol， （iii） water， （iv） methanol:chloroform:water＝10∶3∶1 （V/V）， （v） methanol:chloroform:water＝3∶1∶1 （V/V） and （vi） methanol∶chloroform＝1∶1 （V/V） were compared for their efficiency of metabolites extracting. The metabolites were detected by GC-MS. The results showed that leakage of metabolite occurred when quenched with 75% methanol （－80 ℃）; however this phenomenon did not occur with liquid nitrogen. 47 metabolites were found when extracted with 75% cold methanol， and the relative standard deviation of peak area was 8.0%. In contrast， 40 or less metabolites were detected with other extraction methods， and the reproducibilities of those methods were unsatisfactory. For global analysis， quenching with liquid nitrogen and extraction with 75% cold methanol was very suitable for metabolomics studies of Vibrio parahaemolyticus.

Keywords Vibrio parahaemolyticus; Method for quenching; Method for metabolites extraction; Gas chromatography-mass spectrometry