基于一維DNA組裝磁性納米探針的夾心型安培免疫傳感器研究

摘 要 采用Fe3O4（核）/ZrO2（殼）納米磁珠（ZMPs）標(biāo)記待測物識別抗體，并用HRP酶封閉和DNA鏈接，建立了一類新型的“珠鏈狀”一維磁性納米探針制備方法。將甲胎蛋白（AFP）一抗固定于納米金修飾的玻碳電極表面，構(gòu)建了免疫電極（GCE∣AFP Ab1）?；谠撾姌O和上述合成探針，通過雙抗體夾心法測定免疫產(chǎn)物上HRP酶對過氧化脲 （CP） 氧化對苯二酚反應(yīng)的催化電流，研制了一類基于一維納米結(jié)構(gòu)組裝的夾心型安培免疫傳感器。研究表明：此一維納米結(jié)構(gòu)探針不僅大大增加了酶在電極表面的富集量，成倍擴(kuò)增了催化電流，顯著提高了傳感器的靈敏度，而且易于通過外磁場與背景液可控分離，簡化了分析步驟，并提高了結(jié)果的重復(fù)性。此傳感器對 AFP檢測的線性范圍為0.01～25

1 引 言

甲胎蛋白 （AFP） 含量升高往往預(yù)示著癌癥發(fā)生，故在臨床上普遍作為診斷惡性腫瘤的有效指標(biāo)［1］。AFP 的常規(guī)檢測主要采用放射免疫法（RIA）、酶聯(lián)免疫法 （ELISA）、熒光免疫法 （FIA）和時間分辨熒光免疫法等。上述方法具有準(zhǔn)確、高效等特點，但是步驟繁瑣耗時、血樣用量大、儀器龐大昂貴，無法滿足人員流動性強(qiáng)的用血單位（如血站、口岸）對AFP現(xiàn)場快速檢測的要求。因此，有必要開發(fā)高靈敏、樣品用量小的便攜式 AFP 免疫分析方法。電化學(xué)免疫法將具有高靈敏度的電化學(xué)測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)結(jié)合，相對于傳統(tǒng)的 ELISA法，具有響應(yīng)快、靈敏度高、樣品用量小等特點，是當(dāng)前臨床生化檢驗研究的熱點之一［2，3］。近年來，基于酶聯(lián)免疫分析原理開發(fā)了夾心型安培免疫傳感器，通過雙抗體同時識別抗原生成“三明治”型產(chǎn)物，利用二抗探針表面負(fù)載酶（如HRP）催化特定底物的電化學(xué)反應(yīng)，基于產(chǎn)生的催化電流進(jìn)行定量分析。該類傳感器檢測靈敏度和特異性較“基于一步免疫分析”原理的傳感器顯著提高［4～7］。構(gòu)建高靈敏的該類傳感器關(guān)鍵是簡易合成具有較高酶標(biāo)記密度的探針，以放大檢測信號。

目前，在探針表面固定抗體的常用方法，如物理吸附、共價結(jié)合以及凝膠包埋等，存在牢固度差、繁瑣耗時、生物活性下降等不足。ZrO2 作為一種 Lewis 強(qiáng)酸，通過與蛋白分子上的羧酸［8～10］和 DNA 上的磷酸［10］等基團(tuán)（Lewis 強(qiáng)堿）特異性取向結(jié)合，可被直接用于固定酶及抗體。由于抗體和酶包被在極細(xì)（1～2

SymbolmA@ m）且表面積很大的納米 ZrO2 上，標(biāo)記量顯著增加，且能較長時間地保持生物活性［11］。DNA 和 ZrO2 結(jié)合牢固并具有特異性［7］。但是如采用 DNA 直接固定 ZrO2 制作探針，由于與游離抗體同時存在于懸濁液中，彼此很難分離?；诩{米鐵磁性氧化物（如Fe3O4）材料構(gòu)建磁性納米探針，并在外磁場作用下可控分離結(jié)合探針與游離抗體的方法，具有方便、簡單、快速、徹底等特點［11］。本課題組合成了Fe3O4（核）/ZrO2（殼）磁性納米材料（簡稱ZMPs）［12］，適于構(gòu)建該類磁性探針。由于夾心免疫傳感器的電流響應(yīng)和探針表面標(biāo)記酶濃度呈正比；而 DNA 作為一維長鏈分子含有大量的磷酸基團(tuán)，可固定多個 HRP 酶聯(lián) AFP 抗體 （ZMP sHRPAFP Ab2） 磁珠，進(jìn)而提高探針表面 HRP 酶標(biāo)記量，因此可顯著擴(kuò)增電流響應(yīng)。

本研究通過 DNA 連接多個 ZMPsHRPAFP Ab2 納米磁珠，采用外磁場分離后，制備了具有較高酶標(biāo)記密度的一維磁性納米結(jié)構(gòu)探針（DNA/ （ZMPsHRPAFP Ab2）n）；基于納米金修飾的玻碳電極固定AFP一抗（GCE∣AFP Ab1）作為免疫電極，構(gòu)建一維磁性納米組裝的夾心型安培免疫傳感器，用于AFP的測定。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CHI660B 電化學(xué)分析工作站 （上海辰華儀器公司）；三電極體系：玻碳修飾電極 （GCE，直徑2 mm） 為工作電極，鉑電極 為對電極，飽和甘汞電極 （SCE） 為參比電極；H7650 型透射電鏡（日本Hitachi公司）；X′pert PRO型X射線衍射儀（日本日電公司）；Bruker5200 X射線熒光儀（德國 Bruker 公司）；ST360酶標(biāo)儀（上?？迫A生物技術(shù)）；NdFeB 稀土強(qiáng)磁鐵 （杭州強(qiáng)磁器材有限公司，磁場強(qiáng)度為0.1～1.0 mT）；超純水儀（美國Millipore 公司）。

對苯二酚（HQ）、過氧化脲 （CP），購于上海晶純試劑有限公司；AFP免疫試劑盒（美國Sigma公司）：其中含有AFP單克隆抗體溶液（AFP Ab1）、AFP標(biāo)準(zhǔn)溶液和 HRP 標(biāo)記 AFP 單克隆二抗（HRPAFP Ab2）；0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液 （PBS）；5%小牛胸腺DNA（ctDNA）；牛血清白蛋白 （BSA，美國 SigmaAldrich公司）；辣根過氧化氫酶（HRP，上海國藥公司）。其它試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 ZMPs磁珠及其包被抗體后的ZMPsHRPAFP Ab2磁性微粒的合成和表征

參考文獻(xiàn)［12］，采用共沉淀法合成納米Fe3O4，并在其表面包裹ZrO2，合成了Fe3O4/ZrO2磁性微粒，其粒徑為 45.83～186 nm，平均粒徑為100 nm。Fe3O4/ZrO2（圖1a下）和 Fe3O4 （圖1a上）的XRD圖相比，除了Fe3O4特征峰外，還出現(xiàn)了ZrO2晶體特征峰（2θ＝22°），說明包裹在Fe3O4外層的ZrO2為晶態(tài)。采用X射線熒光光譜 （XRF）對 Fe3O4/ZrO2 進(jìn)行表征，出現(xiàn)了ZrKβ （17.8 keV），

ZrKα（15.8 keV）， ZrLβ （2.1 keV）， ZrLα （2.0 keV）峰和FeKβ （7.1 keV）， FeKα （6.4 keV）峰，說明該磁性微粒中存在 Zr和Fe元素。Fe3O4/ZrO2的透射電鏡圖（圖1b）顯示，其形成了以Fe3O4為核（黑色），ZrO2為殼（白色）的核殼結(jié)構(gòu)。在5 mL 2 g/L ZMPs溶液中加入HRPAFP Ab2，不斷攪拌12 h后，外加磁場分離未結(jié)合的HRPAFP Ab2，反復(fù)洗滌次數(shù)后，采用辣根過氧化氫酶（HRP）進(jìn)一步封閉活性位點，采用透射電鏡表征（圖 1c）可見，ZMPs表面包覆了一層蛋白。

2.3 一維磁性納米探針DNA/ （ZMPsHRPAFP Ab2）n的制備

在5 mL ZMPsHRPAFP Ab2加入100

SymbolmA@ L10 g/L小牛胸腺DNA（ctDNA），在4 ℃的恒溫?fù)u床，以20 r/mim振蕩反應(yīng)24 h，磁性分離，即獲得一維磁性納米結(jié)構(gòu)探針（DNA/ （ZMPsHRPAFP Ab2）n）。采用透射電鏡對探針制備過程進(jìn)行了表征（圖 2a），ZMPsHRPAFP Ab2 探針具有一維“珠鏈狀”線性結(jié)構(gòu)。采用X射線熒光光譜 （測定元素范圍為9F～92U） 對一維磁性探針進(jìn)行了表征，顯示了ZrKα 峰2.1 keV， FeKα峰6.4 keV， PKα峰1.13 keV和SKα峰2.3 keV。由于DNA含有大量磷酸基團(tuán)，故而P峰的出現(xiàn)說明了ZMPs 表面包覆了DNA。由圖2b可見，在0.3 mT外磁場作用下，DNA/（ZMPsHRPAFP Ab2）n 磁性探針在外磁場中可以很好地與背景溶液分離。

2.4 免疫傳感器的制備及檢測原理

圖3顯示了免疫傳感器的檢測原理。修飾有甲胎蛋白一抗的玻碳電極（GCE|AFP Ab1）與 AFP 抗原發(fā)生免疫結(jié)合后，通過夾心模式捕獲相應(yīng)的 DNA/（ZMPsHRPAFP Ab2）n探針，

由此在電極表面獲得“三明治” 型免疫復(fù)合物 （AFP Ab1/AFP/DNA/（ZMPsHRPAFP Ab2）n），在5 mL含5 mmol/L 過氧化脲（CP）及1 mmol/L 對苯二酚（HQ）的0.1 mol/L PBS（除氧）中測定免疫傳感器的響應(yīng)電流。由于夾心免疫復(fù)合物表面的 HRP 可催化 CP 與 HQ 的反應(yīng)，由此產(chǎn)生的催化電流（I）與AFP濃度在一定范圍內(nèi)呈正比關(guān)系，可用于定量分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 免疫傳感器檢測過程的阻抗表征

采用交流阻抗譜對電極修飾過程進(jìn)行表征。如圖4所示，裸 GCE上 FeCN高頻區(qū)的半圓直徑 （Ret）較小。隨著AFP Ab1， AFP， DNA/（ZMPsHRPAFP Ab2）n 膜不斷修飾到 GCE后 （圖 2，b～d），Ret不斷增大，表明各組分被成功修飾到電極表面，修飾膜阻礙了Fe（CN）63－/4－在電極上的電子傳輸。

3.2 免疫傳感器的電化學(xué)行為

圖5為免疫傳感器制備過程中不同電極在0.1 mol/L pH 7.0的PBS中的循環(huán)伏安圖。在－0.6～0.6 V范圍內(nèi)，GCE| AFP Ab1電極（圖5a）在空白的PBS溶液中沒有任何氧化還原峰出現(xiàn)；當(dāng)溶液中加入5 mmol/L CP和 1 mmol/L HQ時，修飾電極 （圖5b） 在－0.15 V和0.25 V出現(xiàn)一對氧化還原峰 （100 mV/s）。該免疫傳感器捕獲AFP，并與“一維磁性探針”形成夾心免疫復(fù)合物后，HQ的還原電流明顯增大，而氧化電流減少（圖5c），顯示出明顯的還原催化電流。這是由于磁性探針中的HRP催化CP氧化HQ反應(yīng)產(chǎn)生的。比較了免疫電極采用不同夾心探針對相同濃度AFP的檢測信號，“一維磁性探針”（圖5c）較未經(jīng)DNA連接的磁性探針（ZMPsHRPAFP Ab2 ）（圖5d） 的還原催化電流明顯提高。這可能是因為一維“珠鏈狀”探針中的DNA可以結(jié)合更多ZMPs納米顆粒，使得電極表面結(jié)合的HRP的量更多，因此催化電流更高。

3.3 最佳免疫測定條件

3.3.1 ZMPs對AFP Ab2， HRP和DNA的吸附 由于二抗上標(biāo)記的HRP酶可以催化3，3′，5，5′四甲基聯(lián)苯胺 （TMB） 顯色，故而可根據(jù)測定吸光度值（OD值）反映ZMPs上HRP酶標(biāo)記AFP Ab2（HRPAFP Ab2）的量。在5 mL 2 g/L ZMPs溶液中分別加入100， 200， 300， 400和500

3.3.2 pH值、溫育溫度及時間的優(yōu)化 支持電解質(zhì)的pH值對免疫傳感器的影響主要表現(xiàn)在兩個方面：影響HRP酶的活性；影響電極反應(yīng)的峰電位。圖6b顯示了在不同pH值下，修飾電極對CP催化還原時的催化電流。當(dāng)pH 7.0時，催化電流最大，表明電極修飾膜內(nèi)HRP的活性最高，此結(jié)果與HRP本來的性質(zhì)相一致［14］。分別以還原峰和氧化峰電位對pH值作圖，在pH 4～8之間得到兩條直線，斜率分別為 －59.87和 －51.72 mV/pH。峰電位隨pH值變化，說明鄰苯二酚的電極反應(yīng)過程有質(zhì)子參與，參與反應(yīng)的質(zhì)子數(shù)與電極反應(yīng)中轉(zhuǎn)移的電子數(shù)之比為1∶1。鑒于鄰苯二酚的電極反應(yīng)是一個2電子過程，可以推算出參與電極反應(yīng)的質(zhì)子數(shù)為2［15］，這與HQ的氧化還原電子得失數(shù)一致。

考察了溫育溫度及時間對催化電流的影響。實驗表明，在室溫下，免疫傳感器具有很好的電流響應(yīng)信號，因此實驗均在室溫下完成，且操作簡便。如圖6c，在室溫下，催化電流隨時間延長而增大，當(dāng)達(dá)到30 min后趨于穩(wěn)定。實驗選擇30 min為最優(yōu)時間。

3.4 免疫傳感器對AFP的安培檢測

在優(yōu)化的測定條件下，采用了示差脈沖伏安法（DPV）測定了AFP樣品，獲得了校正曲線。如圖7所示，隨著AFP含量的增加，免疫傳感器的安培響應(yīng)增大。AFP濃度在0.01～25

SymbolmA@ g/L范圍內(nèi)與傳感器響應(yīng)值對數(shù)值呈線性關(guān)系，R＝0.9943；檢出限為 4 ng/L （3σ）。健康人體內(nèi)AFP的閾值為10

SymbolmA@ g/L，因此該傳感器能很好地應(yīng)用于實際檢測中，無需對樣品進(jìn)行稀釋操作，檢測更為簡便。與其它夾心免疫傳感器進(jìn)行比較（表1）發(fā)現(xiàn)，本方法構(gòu)建的夾心免疫傳感器具有很低的檢出限，很高的檢測靈敏度，比傳統(tǒng)ELISA檢測方法的檢出限低2個數(shù)量級。

3.5 免疫傳感器的精確性、儲存穩(wěn)定性和可更新性

取不同時間、不同批間制備的免疫傳感器對15和25

SymbolmA@ g/L AFP 重復(fù)測定4次，獲得的組內(nèi)相對相對偏差為2.3%和2.2%，說明此免疫傳感器具有良好精密度。傳感器在4 ℃儲存于pH 6.5 PBS中45 d后，未發(fā)生明顯變化 （信號變化＜5%），說明其具有較好的穩(wěn)定性。文獻(xiàn)［18］表明，免疫電極在0.1 mol/L甘氨酸鹽酸鹽溶液浸泡5 min后， 用PBS（pH＝7.4）緩沖液沖洗， 即可實現(xiàn)電極的更新。文獻(xiàn)［19］利用垂直作用于電極的外加磁場的磁力，將磁性二抗探針以及抗原洗脫電極表面，而保持一抗在免疫電極表面，以進(jìn)行再次使用。本實驗將免疫電極浸泡于0.1 mol/L甘氨酸鹽酸鹽溶液，并不斷攪拌，在電解池底部外加0.3 mT磁場，使磁力線方向垂直于電極表面，實現(xiàn)電極的快速更新。其對10和15

3.6 免疫傳感器的抗干擾性

研究了人血清中主要干擾物對傳感器檢測AFP的影響。結(jié)果表明，當(dāng)AFP濃度為5

應(yīng)用本方法測定了人血清中AFP含量（測試前除用0.1 mol/L pH 7.0 PBS稀釋1～20倍外，未經(jīng)其它處理）。在3個樣品中檢測到AFP信號(表2)，結(jié)果與ELISA方法一致，加標(biāo)回收率為95%～110%。

4 結(jié) 論

本研究成功制備了一種基于一維磁性 DNA 納米探針的新型夾心安培免疫傳感器。它具有以下優(yōu)點：（1）采用 Fe3O4/ZrO2（ZMPs）納米磁珠吸附酶標(biāo)二抗，可在外磁場作用下快速簡易地實現(xiàn)與背景液的游離抗體分離，簡化了探針的制備過程；（2）利用 DNA 和 ZrO2 的特異性吸附能力，一條 DNA 鏈可以橋連多個 ZMPs，所獲得的一維磁性納米探針進(jìn)一步提高了酶標(biāo)記量，大大提高了檢測靈敏度。（3）檢測結(jié)束后，在外磁場作用下該探針易于從電極表面洗脫，從而實現(xiàn)免疫傳感器表面更新。該傳感器對AFP測定結(jié)果與ELISA方法具有很好的吻合性，非常適合于血清中 AFP的早期快速篩查。

References

1 GU LiBo， HAN JingHong， Cui DaFu， ZHANG Hong（顧麗波， 韓涇鴻， 崔大付， 張 虹）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學(xué)）， 2005， 33（1）: 17～21

2 ZHAO ChangZhi， JIAO Kui ， FENG ChunLiang （趙常志， 焦 奎， 馮春良）. Chinese J. Anal. Chem. （分析化學(xué)）， 2005， 33（10）: 1467～1478

3 Ran X Q， Yuan R， Chai Y Q， Hong C L， Qian X Q. Colloids and Surfaces B， 2010， 79: 421～426

4 Wu Y， Chen C， Liu S. Anal. Chem.， 2009， 81: 1600～1607

5 Du D， Zou Z， Shin Y， Wang J， Wu H， Engelhard M H， Lin J， Aksay L A， Lin Y. Anal. Chem.， 2010， 82（7）: 2989～2995

6 Cui R， Zhu J. Electrochimica Acta， 2010， 55（27）: 7814～7817

7 Malhotra R， Patel V， Vaque J P， Gulkin J s， Rusling J F. Anal. Chem.， 2010， 82: 3118～3123

8 Hu Y， Carr P W. Anal. Chem.，  1998， 70: 1934～1942

9 Buscher C， Mebraneh D， Li D. Amermican Chemical Society， 1996， 118: 2950～2953

10 XIE Yi， YUAN Ruo， CHAI YaQin， XU DongPo （謝 軼， 袁 若， 柴雅琴， 許東坡）. Chemical Sensors（化學(xué)傳感器）， 2008， 28 （2）: 32～38

11 WU YuanZhao， XU WeiLian， HOU JianGuo， GAN Ning， LI TianHua（巫遠(yuǎn)招， 徐維蓮， 侯建國， 干 寧， 李天華）. Chin.J.Pestic.Sci.（農(nóng)藥學(xué)學(xué)報）， 2010， 12（2）: 178～184

12 Xu X， Friedman G， Humfeld K D， Majetich S A， Asher S A. Chemistry Material，  2002， 14: 1249～1256

13 YANG Xin， GAN Ning， XIE DongHua， WEN WeiGang， LUO NaiXing （楊 欣， 干 寧， 謝東華， 聞偉剛， 羅乃興）. Acta Chimca Sinica（化學(xué)學(xué)報）， 2010， 68（1）: 75～82

14 Yu J， Ju H. Anal. Chim. Acta，  2003， 486 （2）: 209～216

15 Yu J， Ju H. Anal. Chem.， 2002， 74（14）: 3579～3583

16 Tang T， Su B， Tang D， Chen G. Biosensors and Bioelectronics， 2010， （25） : 2657～2662

17 Yuan S， Yuan R， Chai Y， Mao L， Yang X， Yuan Y， Niu H. Talanta， 2010， 82 : 1468～1471

18 Tang D， Tang J， Su B， Chen G. J. Agric. Food Chem.，  2010， 58: 10824～10830

19 Zhuo Y， Yuan P， Yuan R， Chai Y， Hong C. Biomaterials， 2009， 30: 2284 ～2290

A Sandwich Amperometric Immunosensor Based on

Onedimensional Assembly of Magnetic DNA Nanoprobe

WU YuanZhao1， GAN Ning*1， HU FuTao1， LI TianHua1， CAO YuTing1， ZHENG Lei*2

1（The State Key Laboratory Base of Novel Functional Materials and Preparation Science，

Faculty of Material Science and Chemical Engineering of Ningbo University， Ningbo 315211）

2（Clinical Laboratory Center， Nanfang Hospital， Southern Medical University， Guangzhou 510515）

Abstract A new type of onedimensional magnetic nanoprobes was fabricated based on a DNA chain fixed with a number of Fe3O4 （core）/ZrO2 （shell） nanomagnetic beads （ZMPs） labeled with secondary antibody. The αfetoprotein （AFP） was analyzed by using probes DNA/（ZMPsHRPAFP Ab2）n and immobilizing αfetoprotein antibody （AFP Ab1） onto the glassy carbon electrode modified by nanogold. The sandwichtype immunocomplex could be formed between the immobilized AFP Ab1 on the GCE and the probes DNA/（ZMPsHRPAFP Ab2） n and the carried HRP could catalyze the electrochemical reduction ofcarbamide peroxide （CP） with the help of hydroquinone （HQ）. The novel onedimensional nano structureassemble and sandwichtype amperometric immunosensor was developed. Enhanced sensitivity was achieved by introducing more HRPAFP Ab2 onto the electrode surface through the pearl chain structure. Under optimal conditions， the proposed method could respond to 4 ng/L AFP with a linear calibration range from 0.01 to 25

SymbolmA@ g/L. The immunosensor was employed to determine AFP in serum samples and the results were satisfactory. The proposed amperometric immunosensor was sensitive， quick， magnetic field controllable. This study provided a platform technology for developing a onedimensional assembly and highly sensitive immunosensor， which was suitable for screen determination of tumors in serums of normal patients.

Keywords Deoxyribonucleic acid; Ferroferric oxide/zirconium dioxide; One dimensional magnetic nanoprobes; αFetoprotein; Sandwich electrochemical immunosensor