蟲(chóng)草腎茶膠囊對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1及細(xì)胞外基質(zhì)的影響

金麗霞，宋立群，宋業(yè)旭

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎病科，哈爾濱150040)

糖尿病腎病(DN)的病理特點(diǎn)是腎小球基底膜增厚和以系膜區(qū)為主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積聚。ECM的主要成分包括纖維連接蛋白(FN)、層粘連蛋白(LN)等［1］。系膜細(xì)胞(MC)是腎小球硬化時(shí)分泌ECM的主要細(xì)胞。正常情況下，MC可以分泌少量基質(zhì)成分，但在受到各種病理刺激時(shí)，MC活化并分泌大量的細(xì)胞因子和ECM［2］。因此，抑制MC分泌ECM，是防治腎小球硬化的重要環(huán)節(jié)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)在調(diào)控ECM的聚積中起著重要作用。TGF-β1在腎小球疾病進(jìn)展中的作用仍是目前研究的熱點(diǎn)。

蟲(chóng)草腎茶膠囊由發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉、黃芪、制大黃、貓須草(別名腎茶)、水蛭、草豆蔻六味藥物組成。以往的臨床研究結(jié)果顯示:蟲(chóng)草腎茶膠囊治療DN療效較好，能改善患者的一般狀況和相關(guān)生化指標(biāo)，保護(hù)腎臟功能，延緩DN的進(jìn)程［3］。早期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)它可以保護(hù)腎臟［4-7］，本研究進(jìn)一步觀察了蟲(chóng)草腎茶膠囊對(duì)高糖培養(yǎng)下HMC分泌 TGF-β1及ECM的影響，進(jìn)一步探討蟲(chóng)草腎茶膠囊對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 人腎小球系膜細(xì)胞株由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院腎內(nèi)科焦軍東教授惠贈(zèng);蟲(chóng)草腎茶膠囊由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制備，每粒膠囊重0.45g，福辛普利(蒙諾):規(guī)格:10mg/片;批號(hào):070511，由中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)。改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Hy-Clone公司;TGF-β1ELISA試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司;FN ELISA試劑盒及LN ELISA試劑盒購(gòu)自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制備含藥血清 健康雄性 Wistar大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，即正常組(20只)、福辛普利組(10只)、蟲(chóng)草腎茶低劑量組(10只)、蟲(chóng)草腎茶中劑量組(10只)和蟲(chóng)草腎茶高劑量組(10只)，蟲(chóng)草腎茶低、中、高劑量組分別按0.243 g·kg－1·d－1、0.486 g·kg－1·d－1及 0.972 g·kg－1·d－1的蟲(chóng)草腎茶膠囊灌胃給藥，福辛普利組按0.9 mg·kg－1·d－1的福辛普利灌胃給藥，正常組給予等體積0.9%氯化鈉注射溶液灌胃，1次/d，連續(xù)給藥7 d。在末次灌胃2 h后麻醉，在無(wú)菌條件下經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，3000 r/min離心15 min后取血清，56℃水浴30 min滅活補(bǔ)體，經(jīng)0.22μm孔徑的針頭濾器過(guò)濾除菌，分裝－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理 實(shí)驗(yàn)分6組，即健康對(duì)照組、高糖組、福辛普利組、蟲(chóng)草腎茶低、中、高劑量組，每組各10只。健康對(duì)照組予含10%正常大鼠血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)干預(yù)，高糖組予含10%正常大鼠血清的高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)干預(yù)，蟲(chóng)草腎茶低、中、高劑量組分別予含10%蟲(chóng)草腎茶低、中、高劑量含藥血清的高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)干預(yù)，福辛普利組予含10%福辛普利含藥血清的高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)干預(yù)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMC用0.25%胰蛋白酶消化后種入24孔板，使每孔含細(xì)胞2×104個(gè)，用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h待細(xì)胞完全貼壁后，用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液使細(xì)胞同步化24 h。實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理同上。實(shí)驗(yàn)時(shí)培養(yǎng)液血清濃度均為10%，分別培養(yǎng)48 h和72 h后終止培養(yǎng)，收集上清液，1500 r/min×10 min離心后－80℃保存待測(cè)。

1.2.4 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清 TGF-β1、FN及LN含量 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2 結(jié)果

本研究結(jié)果提示，高糖可刺激TGF-β1的分泌，高糖組隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，TGF-β1的分泌增加;蟲(chóng)草腎茶膠囊對(duì)TGF-β1分泌的抑制作用呈時(shí)效和量效關(guān)系。在抑制TGF-β1的分泌方面，蟲(chóng)草腎茶膠囊優(yōu)于福辛普利。

高糖組FN含量在48 h及72 h均明顯升高，與健康對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01)。提示高糖具有促進(jìn)HMC FN分泌的作用。在抑制FN的分泌方面，蟲(chóng)草腎茶膠囊優(yōu)于福辛普利。

正常培養(yǎng)條件下，HMC可分泌一定量的LN，經(jīng)高糖刺激后，在48 h和72 h，LN的分泌均明顯增加(P＜0.01)，提示高糖可促進(jìn)體外培養(yǎng)的HMC LN的分泌。在一定程度上，蟲(chóng)草腎茶膠囊對(duì)高糖培養(yǎng)下人腎小球系膜細(xì)胞分泌LN的抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系，見(jiàn)表1。

3 討論

糖尿病腎病的發(fā)病受多種因素影響，發(fā)病機(jī)制至今仍不十分清楚，它的主要病理改變是毛細(xì)血管基底膜的增厚及細(xì)胞外基質(zhì)的增加，最終導(dǎo)致腎小球硬化。TGF-β是一種多功能的細(xì)胞因子，在腎臟中以TGF-β1的含量最為豐富。體外實(shí)驗(yàn)表明:高糖可刺激MC分泌TGF-β1［8］。我們的研究結(jié)果再次證實(shí)了在高糖條件下，TGF-β1表達(dá)增加，與既往文獻(xiàn)報(bào)道的相同。ECM積聚是導(dǎo)致腎小球硬化的重要因素，ECM生成增多和(或)降解減少是ECM積聚的主要原因。ECM主要成分為Col-IV、FN、LN等。Col-IV增多是腎小球硬化發(fā)生、發(fā)展的重要因素［9］。前期的研究已經(jīng)證實(shí)蟲(chóng)草腎茶膠囊藥物血清對(duì)高糖刺激下的系膜細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，并能抑制高糖刺激下Col-IV的分泌［10］。另有研究［11］發(fā)現(xiàn)，在腎小球炎癥早期FN迅速出現(xiàn)，中、后期亦維持較高水平，至后期Col-IV才明顯增多，提示FN是一種始動(dòng)因素。LN是細(xì)胞基膜的主要成分，DN中FN與LN含量增加，尤其是FN的變化出現(xiàn)早而明顯，隨后增多的是膠原蛋白，表現(xiàn)為ECM的積聚、基底膜增厚，這些改變?cè)贒N的發(fā)生發(fā)展中具有特征性病理意義。

表1 各組HMC培養(yǎng)液上清中TGF-β1、FN、LN含量的比較(±s)

表1 各組HMC培養(yǎng)液上清中TGF-β1、FN、LN含量的比較(±s)

注:同時(shí)間與健康對(duì)照組比較，a P ＜0.01;同時(shí)間與高糖組比較，b P ＜0.05，c P ＜0.01

組別 鼠數(shù)(只)TGF-β1(pg/ml)FN(ng/ml)LN(ng/ml)48h 72h健康對(duì)照組 10 58.97 ±2.56 67.63 ±2.20 35.99 ±2.42 54.9 48h 72h 48h 72h 9 ±2.70 22.05 ±1.05 25.17 ±1.19高糖組 10 78.10 ±3.09a 130.29 ±3.25a 56.12 ±3.70a 115.38 ±3.54a 33.75 ±1.44a 47.51 ±1.26a蟲(chóng)草腎茶低劑量組 10 76.37 ±2.47 124.87 ±3.07b 53.38 ±2.91 111.58 ±3.55b 32.05 ±1.83 45.44 ±1.44b蟲(chóng)草腎茶中劑量組 10 71.83 ±3.85b 73.28 ±3.83c 51.64 ±3.62 90.99 ±2.36c 31.75 ±2.26 39.54 ±1.24c蟲(chóng)草腎茶高劑量組 10 63.25 ±2.75c 71.62 ±3.95c 50.55 ±2.81b 64.54 ±2.31c 27.61 ±1.70c 27.44 ±1.67c福辛普利組 10 73.68 ±3.95 79.51 ±3.89c 51.61 ±3.37 79.75 ±3.86c 31.75 ±1.80 29.23 ±1.62c

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)的48 h和72 h，在正常葡萄糖濃度條件培養(yǎng)下，HMC可表達(dá)一定量的 TGF-β1、FN 及 LN，高糖刺激后，TGF-β1、FN 及LN的表達(dá)均明顯增加，蟲(chóng)草腎茶與福辛普利均降低了高糖條件下HMC TGF-β1、FN及LN的表達(dá)，從而起到了抑制ECM積聚，延緩DN進(jìn)展的作用，在抑制TGF-β1、FN、LN的表達(dá)方面，蟲(chóng)草腎茶膠囊高劑量組顯示出較好的療效，作用優(yōu)于福辛普利組。

蟲(chóng)草腎茶膠囊能夠抑制TGF-β1的表達(dá)，減少ECM積聚，具有延緩腎小球硬化進(jìn)展的作用。對(duì)腎小球硬化機(jī)制的認(rèn)識(shí)，仍有眾多問(wèn)題有待深入，尤其是在錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中，如何把握關(guān)鍵的細(xì)胞，找出啟動(dòng)因子，蟲(chóng)草腎茶膠囊是如何中斷連鎖反應(yīng)和使已出現(xiàn)的異常的過(guò)多沉積逆轉(zhuǎn)為生理平衡等，都有著深刻的理論意義和臨床實(shí)用價(jià)值，因此，在這方面依然任重而道遠(yuǎn)。

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