腎衰復(fù)顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

廣東省深圳市康寧醫(yī)院 李?；?劉紀(jì)青 熊明玲（深圳 518001）

腎衰復(fù)顆粒由黃芪、丹參、大黃、益母草、枸杞子等組成,具有益氣養(yǎng)陰,活血化瘀,解毒泄?jié)岬墓π?。用于各種原因所致的慢性腎功能不全氮質(zhì)血癥期和尿毒癥早期。本品由深圳市中醫(yī)院制劑室制成,為控制本品的質(zhì)量,筆者用薄層色譜法對黃芪、丹參、大黃、益母草進(jìn)行定性鑒別,用高效液相色譜法測定腎衰復(fù)顆粒中甜菜堿含量,制定腎衰復(fù)顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明本方法效果較好,可用于控制本品的內(nèi)在質(zhì)量。

1 實驗材料

1.1 儀器與試劑 HPLC儀,色譜柱:包括 LC-10AT型泵、SPD-10A型紫外檢測器 （日本島津公司）;N2000型色譜工作站 （浙江大學(xué)）;FA/JA型電子天平 （上海精密科學(xué)儀器有限公司）;乙晴 （色譜純,美國天地公司）;其它試劑均為分析純,水為超純水。硅膠 G、硅膠 H（青島海洋化工廠）。

1.2 材料 黃芪對照藥材、丹參對照藥材、大黃對照藥材、益母草對照藥材、大黃素、大黃酚、鹽酸水蘇堿、甜菜堿對照品均購自中國藥品生物制品檢定所;試驗所用飲片均來源于深圳市中醫(yī)院中藥房,由本院藥檢室鑒定,枸杞為茄科植物寧夏枸杞的干燥成熟果實。其它均符合 《中國藥典》規(guī)定。腎衰復(fù)顆粒 （深圳市中醫(yī)院制劑,批號:100301 100315 100330）。

2 定性鑒別

2.1 黃芪[1]的鑒別 取黃芪 10g,研細(xì),加乙醇 40mL。超聲處理 1 h,濾過,濾液蒸干,殘渣加水 10mL,微熱使溶解。用水飽和的正丁醇振搖提取 3次,每次 20mL合并正丁醇提取液。用氨試液洗滌 2次,每次 20m L,棄去氨液,正丁醇蒸干,殘渣加水 5 mL使溶解,通過已處理的D 101型大孔樹脂柱 （內(nèi)徑 1.5 cm,長 12 cm）,以水 50mL洗脫,棄去水液,再用40%的乙醇 30mL洗脫,棄去40%的乙醇溶液,繼用 70%的乙醇 50mL洗脫,收集洗脫液,蒸干,殘渣加乙醇 1m L使溶解,作為供試品溶液。另取黃芪對照藥材 1g,同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗,吸取上述兩種溶液各 5μL,分別點于同一硅膠G板上,以三氯甲烷 -甲醇 -水 （13︰ 7︰ 2）的下層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,噴以 10%的硫酸乙醇溶液,供試品中,在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點。

2.2 丹參[1]的鑒別 取丹參 10 g,研細(xì)。用石油醚 20 m L,振搖,靜置 1h,濾過,濾液揮干,殘渣加乙酸乙酯 1 m L使溶解,作為供試品溶液,另取丹參對照藥材 1g,同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗,吸取上述二種溶液各 10μL,分別點于同一含羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠 G薄層板上,以苯 -乙酸乙酯 （19︰ 1）為展開劑,展開,取出,晾干。供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的紅色斑點。

2.3 大黃[2-3]的鑒別 取大黃 10g,研細(xì),加三氯甲烷10mL,濾過,濾液蒸干,加三氯甲烷 1mL使溶解,作為供試品溶液。取大黃對照藥材 0.2 g,研細(xì),加三氯甲烷10mL,濾過,濾液蒸干,加三氯甲烷 1m L使溶解,作為大黃對照藥材溶液。再取大黃素、大黃酚對照品,加三氯甲烷分別制成每 1mL含 1mg的溶液,作為大黃素、大黃酚對照品溶液。照薄層色譜法試驗,吸取上述四種溶液各10μL,分別點于同一含羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上,以石油醚 （60℃）-甲酸乙酯 -甲酸 （15︰5︰ 1）的上層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈 （365nm）下檢視。供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同橙黃色熒光主斑點;在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的橙黃色熒光斑點,置氨氣中熏后,日光下檢視,斑點變?yōu)榧t色。

2.4 益母草[4]的鑒別 取益母草 10 g,研細(xì),加乙醇50mL,振搖使溶解,濾過,濾液置水浴上濃縮至約 5mL,加無水乙醇 50m L,攪拌,濾過,濾液置水浴上濃縮至約1mL,作為供試品溶液。取鹽酸水蘇堿對照品,加無水乙醇制成含每 1mL含 1mg的溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗,吸取上述兩種溶液各 10μL,分別點于同一含羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠 G薄層板上,以正丁醇 -鹽酸 -乙酸乙酯 （8︰ 3︰ 1）為展開劑,展開,取出,晾干,噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同的橙紅色的斑點。

3 甜菜堿[5]含量測定

3.1 供試品溶液的制備 取枸杞子剪碎,取約 10 g,精密稱定,加80%甲醇 50m L,超聲提取30min,放冷,濾過,用 80%甲醇溶液 30m L,分次洗滌殘渣和濾器,合并洗液和濾液,蒸干,殘渣加 0.1mol/L鹽酸溶液10m L使溶解,加入活性炭 1 g,置水浴中加熱 2min,邊加熱邊攪拌,放冷,濾過,用 0.1mol/L鹽酸 15mL分次洗滌燒杯和濾器,合并洗液和濾液,加入新配制的 2.5%硫氰酸鉻銨溶液 20mL,攪拌均勻,置冰浴中放置 3 h。用 G4垂熔漏斗濾過,沉淀用少量冰水 （約 10 mL）洗滌,抽干,殘渣用丙酮 15m L分次溶解并抽干,在丙酮液中滴加 0.5%硫酸銀溶液 （約 5m L）至不再有沉淀產(chǎn)生,放置,濾過,用70%乙醇 20m L分次洗滌沉淀和容器,合并洗液和濾液,置水浴上濃縮至約 1 mL,放冷,加入與硫酸銀等當(dāng)量的1%氯化鋇溶液 （約 1.7 mL）,蒸干,殘渣加水適量使溶解,轉(zhuǎn)移至 50m L量瓶中并用水稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液用 0.45μm濾過,作為供試品溶液。

3.2 對照品溶液的制備 取甜菜堿對照品適量,精密稱定,用水溶解并制成每 1mL含 80μg的溶液,即得。

3.3 陰性對照溶液 按處方的工藝要求制備缺枸杞子的陰性樣品,同供試品溶液制備方法制成空白對照溶液。

3.4 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱:YWGC18（粒度 10μm）;流動相:乙腈 -0.05mol/L磷酸二氫鉀 -磷酸 （15︰ 85︰ 0.18）;檢測波長為 192 nm;柱溫:30℃;流速:1mL/min。測得對照品、樣品和陰性對照樣品色譜圖。

3.5 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液 2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、 15.0μL,注入液相色譜儀,按上述色譜條件測定峰面積,以對照品的量 （μg）為橫坐標(biāo),峰面積 （A）為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:A=406 796.973C-12 232.568（r=0.999 7）,結(jié)果表明甜菜堿進(jìn)樣量為 10μL,在 0.20～1.20μg范圍內(nèi),其對照品的量與峰面積呈良好的線形關(guān)系,含量測定采用外標(biāo)法。

3.6 精密度試驗 精密吸取濃度為 0.08mg/mL的對照品溶液 10μL,連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣 6次,測定甜菜堿峰面積值,結(jié)果RSD為0.64%,表明精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗 取枸杞子剪碎,取約 1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,按供試品溶液的制備方法,制得供試品溶液,分別精密吸取供試品溶液 10μL于 0、 2、 4、 8、 24 h后,進(jìn)樣,記錄色譜圖與峰面積,結(jié)果RSD為 0.91%,表明樣品溶液在 24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.8 重現(xiàn)性試驗 取同一批枸杞子藥材,按上述含量測定方法,分別制備 6份供試品液,精密吸取供試品液各 10 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖與峰面積,結(jié)果 RSD為0.86%,表明本法測定的重現(xiàn)性良好。

3.9 加樣回收率試驗 取已知含量為 3.269mg/g的枸杞子,剪碎,取約 5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,共 6份,再分別精密加入甜菜堿對照品溶液 （溶劑為甲醇,濃度為 0.08mg/m L）7.5mL,然后按供試品溶液制備項下的方法操作測定,記錄色譜圖,考察本方法的加樣回收率,結(jié)果本方法的加樣回收率為 98.99%,RSD為 0.86%。

3.10 樣品的測定結(jié)果 3批樣品甜菜堿含量測定結(jié)果:100301樣品結(jié)果為 0.74%,100315樣品結(jié)果為 0.61%,100330樣品結(jié)果為 0.52%。

4 討論

本試驗曾對另外幾種中藥飲片進(jìn)行薄層色譜鑒別,經(jīng)重復(fù)性試驗未達(dá)到理想的效果,考慮黃芪、丹參、大黃、益母草在處方中相對用量較大,所以采用薄層色譜法對本品中的黃芪、丹參、大黃、益母草進(jìn)行定性鑒別,結(jié)果表明方法較好。用高效液相色譜法測定本品中甜菜堿的含量。

提取方法的比較:曾比較了 80%甲醇加熱回流 30 min,超聲處理 20、30、60min等樣品提取方法,結(jié)果顯示超聲提取 30min,即可將供試品中甜菜堿提取完全,故提取方法采用超聲處理提取時間定為 30min。

[1] 劉桂珍,劉紀(jì)青,廖朝峰,等 .完善滋腎降糖丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 [J].河北中醫(yī)藥學(xué)報,2011,26（1）:33-34

[2] 呂武清,龍新華.中成藥中的藥材薄層色譜鑒別 [S].北京:人民衛(wèi)生出版社,1996.47-470

[3] 李麗華,竇玉紅,李國川.高效液相法測定小承氣膠囊中大黃素的含量 [J].河北中醫(yī)藥學(xué)報,2008,23（3）:41

[4] 嚴(yán)優(yōu)芍,李衛(wèi)民.HPLC測定益母草分散片中鹽酸水蘇堿的含量 [J].廣東藥學(xué)學(xué)報,2006,22（6）:604-606

[5] 袁秀枝,劉焱文,孫緒舉,等.HPLC測定復(fù)方龜鹿顆粒中甜菜堿的含量 [J].中國中藥雜志,2006,31（6）:225

（2011-01-26 收稿）