nNOS參與藥物成癮時中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能變化

李華 王麗 秦星

成癮研究關(guān)鍵在于了解濫用藥物如何改變大腦并引起具有成癮特征的異常行為的復(fù)雜途徑。該領(lǐng)域的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一是認定在大腦中，藥物誘導(dǎo)的相對穩(wěn)定的改變以解釋那些持續(xù)存在的行為異常。例如，對藥物成癮的人在戒除藥物若干年后，仍可能存在高風險的復(fù)吸。這些異常行為的穩(wěn)定性提示，它們可能至少部分通過基因表達的改變。慢性嗎啡引起神經(jīng)元的可塑性和適應(yīng)性改變的基礎(chǔ)被認為是轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)一些基因表達蛋白增加，使機體穩(wěn)態(tài)重建的結(jié)果。轉(zhuǎn)錄因子CREB經(jīng)磷酸化激活調(diào)控靶基因表達上調(diào)在其中起重要作用［1］。神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)基因受CREB調(diào)控［2，3］，該基因被認為參與嗎啡依賴和耐受的形成［4］。CREB通過與nNOS基因外顯子2啟動子內(nèi)的CRE序列作用調(diào)控nNOS基因表達［2，5］，且外顯子2是nNOS基因翻譯的起始部位［5］。本文就nNOS基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布及功能作一綜述。

1 nNOS的活性調(diào)節(jié)

nNOS為Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴型(calcium/calmodulin-dependent isoforms)，合成及釋放NO量較少(pM)。胞漿內(nèi)游離Ca2+(free cytosolic Ca2+)是nNOS活性最重要的調(diào)節(jié)者，它通過與鈣調(diào)蛋白相互作用而激活nNOS。動作電位激活位于神經(jīng)膜上的電壓依賴Ca2+通道，并激活細胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+。鈣調(diào)蛋白與nNOS結(jié)合并激活nNOS需胞漿內(nèi)游離Ca2+濃度升至400 nM以上。當Ca2+濃度降低時，Ca2+與鈣調(diào)蛋白分離，從而導(dǎo)致鈣調(diào)蛋白與nNOS分離。這樣Ca2+/鈣調(diào)蛋白象開關(guān)一樣控制nNOS的活性。盡管對磷酸化知之甚少，但其構(gòu)成調(diào)節(jié)nNOS活性的另一機制。cAMP依賴蛋白激酶(cyclic AMP-dependent protein kinase)、蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)或Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，Ca2+/CaMKⅡ)導(dǎo)致的磷酸化降低nNOS的催化活性［6］。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central neuronal system，CNS)，調(diào)節(jié)NO的合成主要依賴Ca2+通過受體依賴的離子通道內(nèi)流(influx)，尤其通過興奮性神經(jīng)遞質(zhì)如谷氨酸激活突觸后NMDA受體［7］。nNOS氨基末端具有一個PDZ結(jié)構(gòu)域，其有大約100個氨基酸組成，并與許多蛋白質(zhì)作用，把它們錨定到細胞骨架元件(cytoskeletal element)，如synaptic densitie和相應(yīng)的膜相關(guān)鳥氨酸激酶(membrane-associated guanylate kinase)。在nNOS存在的情況下，PDZ結(jié)構(gòu)域與突觸后密度蛋白(postsynaptic density protein)PSD-95相互作用，而NMDA受體由于包含一個 Ser/Thr-X-Val基序(motif)，故也可與PSD-95結(jié)合。作為支架蛋白(scaffolding protein)，PSD-95可使NMDA受體接近nNOS，并直接使nNOS暴露在通過激活NMDA受體而產(chǎn)生的進入離子通道的Ca2+流中。其它受體激活所引起的短暫的Ca2+流，由于濃度太低，當這些受體接近nNOS時，不能產(chǎn)生相似的作用。NO的生物活性可能反饋控制離子通道，如關(guān)鍵的半胱氨酸S－亞硝酰化作用(S-nitrosylation)，可下調(diào)NMDA受體。有很多潛在的NMDA受體/nNOS偶聯(lián)及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)者。nNOS配體PDZ的羧基末端蛋白(protein carboxy-terminal PDZ ligand of nNOS，CAPON)被認為與nNOS活性相關(guān)，并與nNOS分布區(qū)域相似。CAPON通過與與PDZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，使nNOS與質(zhì)膜分離。因此，CAPON決定與質(zhì)膜結(jié)合的nNOS的數(shù)目，以此調(diào)節(jié)CNS中神經(jīng)元內(nèi)NO的合成。此外，CAPON可將nNOS錨定到其它的大分子(macromolecule)上，如the small G-protein Dexras-1，這一過程的意義尚不知曉［6］。

nNOS也可通過與nNOS蛋白抑制劑(protein inhibitor of nNOS，PIN)相互作用而被抑制。PIN為一種高度保守的小分子蛋白質(zhì)，最初被認為能破壞nNOS二聚體的穩(wěn)定性而作為內(nèi)源性nNOS抑制劑?？墒牵罱鼒蟮捞崾綪IN是nNOS的軸突運輸?shù)鞍?，而不是它的調(diào)節(jié)者。nNOS可能通過與caveolin-1和caveolin-3相互作用，把鈣調(diào)蛋白從nNOS上置換下來而被抑制。此外，caveolin家族成員可與其它的信號分子，如c-src，Ha-ras和GS相互作用，這些提示nNOS在其它的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中具有潛在作用。另外，熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)可調(diào)節(jié)血紅素(haem)與nNOS的相互作用［6］。

在氮能神經(jīng)元，存在突觸前自動調(diào)節(jié)(presynaptic automodulation)，這一調(diào)節(jié)作用可能是NO與血紅素類型的NOS共同作用的結(jié)果。研究表明，細胞維持低水平的cGMP以產(chǎn)生NO，其原因在于細胞內(nèi)Ca2+水平增加，激活nNOS的同時，也激活Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴的 cGMP磷酸二酯酶(Ca2+/calmodulindependent cyclic GMP phosphodiesterase)，以降解 cGMP［6］。

2 NO的合成及其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程

內(nèi)源性NO是由一組一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催L-精氨酸(L-arginine，L-Arg)末端胍基中的一個氮原子氧化而合成，并使L-Arg轉(zhuǎn)變?yōu)?L-瓜氨酸(L-citrulline)。NOS家族包括三個成員，即I型(type I)為nNOS，II型(type II)為誘導(dǎo)型NOS(inducible NOS，iNOS)，III型(type III)為內(nèi)皮型 NOS(endothelial NOS，eNOS)。這些異構(gòu)體(isoform)盡管結(jié)構(gòu)相關(guān)，但它們的遺傳起源、解剖分布、離子依賴的活性和病理生理作用各不相同。nNOS和eNOS為固有型，在許多細胞和組織中均有表達，為Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性;iNOS為非Ca2+依賴型，存在于所有的細胞類型中，巨噬細胞和血管平滑肌細胞內(nèi)含量最多，在炎癥、疾病及組織損傷時其生成增加［7］。

NOS包含兩個不同的結(jié)構(gòu)域，氨基末端結(jié)構(gòu)域(NH2-terminal domain)包含L-Arg結(jié)合位點，而羧基末端還原酶結(jié)構(gòu)域(COOH-terminal reductase domain)能把電子轉(zhuǎn)移到氨基末端結(jié)構(gòu)域，并含有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的結(jié)合位點，該位點序列高度保守［6，7］。

氮能神經(jīng)這一名稱的采用反應(yīng)了該神經(jīng)的遞質(zhì)功能依賴于NO的釋放或其傳遞過程由NO所引起，這些過程強調(diào)了NO特殊性質(zhì)。NO的物理特性使其不能儲存在脂質(zhì)層的囊泡內(nèi)，也不能被降解酶水解。因此，與經(jīng)典遞質(zhì)不同，NO及不儲存于囊泡，也不以胞裂外排方式釋放，僅僅依靠從神經(jīng)末梢擴散［6］。

NO的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，主要通過激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble of guanylyl cyclase，sGC)偶聯(lián)的受體，導(dǎo)致cGMP在胞漿堆積，從而啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)［8］。其可能性的受體有五種，即四種異源二聚體(alpha1beta1，alpha2beta1，alpha1beta2，alpha2beta2)和一種同源二聚體(nubeta2)。NO的作用是通過其與眾多蛋白質(zhì)的半胱氨酸的巰基、S-nitrosylation及金屬中心發(fā)生作用而影響蛋白質(zhì)功能。sGC一直被認為是nNOS發(fā)揮生理作用的主要靶點，并有充分的證據(jù)表明cGMP水平升高介導(dǎo)NO眾多的生理功能。免疫組織化學(xué)技術(shù)證明sGC和cGMP的分布與nNOS互補。在功能上，氮能神經(jīng)(nitrergic nerve)受刺激或應(yīng)用NO供體(NO-donor)可增加細胞內(nèi)cGMP濃度。而這些反應(yīng)可被cGMP類似物模擬，而抑制cGMP降解可加強氮能神經(jīng)受刺激的結(jié)果。在CNS和外周的平滑肌，NO眾多的作用與cGMP升高之間的機制目前尚不清楚，但其最終結(jié)果是細胞內(nèi)游離 Ca2+濃度(intracellular free Ca2+concentration，［Ca2+］i)降低。cGMP另外的靶點可能涉及開放Ca2+和Na+內(nèi)流的離子通道，cGMP依賴蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase，PKG)的激活，與環(huán)二磷酸腺苷核糖(cyclic adenosin diphosphate ribose)相關(guān)的作用及通過調(diào)節(jié)cGMP依賴磷酸二酯酶(cyclic GMP-dependent phosphodiesterase)而與 cAMP 相互作用［6］。

在血管和神經(jīng)系統(tǒng)，PKG是NO和cGMP主要的效應(yīng)器。分子水平的研究證實，兩個遺傳位點編碼哺乳動物的PKG。編碼PKGⅠ的基因已被從牛肺的血管平滑基細胞的可溶性提取物中分離出來并測序。其cDNA的分子克隆證實，氨基末端不同的剪接方式產(chǎn)生PKGI和PKGI異構(gòu)體。近來來自大腦和腸粘膜上皮的膜相關(guān)PKGⅡ已被克隆。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，PKG酶活性在小腦選擇性升高，而組織化學(xué)顯示高水平的PKGI蛋白存在于浦肯野神經(jīng)元［8］。

在線粒體，NO調(diào)節(jié)氧的消耗。納摩爾濃度的NO抑制線粒體呼吸鏈中的細胞色素氧化酶(cytochrome oxidase)及末端含血紅素的酶。最近證據(jù)證明這種效應(yīng)是可逆的，氧可在此過程中同NO競爭，這些提示NO是產(chǎn)生能量和通過線粒體介導(dǎo)細胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。NO的這一作用參與細胞或組織的損傷過程。另外，與糖酵解能力不同有關(guān)，NO的這一作用可解釋為什么神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞對NO誘導(dǎo)的損傷顯示不同的敏感性［6］。

NO與其他的神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和它們產(chǎn)生的效應(yīng)有關(guān)，尤其是乙酰膽堿(acetylcholine)、去甲腎上腺素(noradrenaline)、多巴胺(dopamine)、谷氨酸(glutamate)、-氨基丁酸(-aminobutyric acid)、血清素(serotonin)、三磷酸腺苷(adenosin triphosphate)、蛙皮素(bombesin)、一氧化碳(carbon monoxide)、阿片(opioid)及內(nèi)皮素(endothelin)。這些相互作用的機制目前未完全了解，但受體直接的S－亞硝酰化作用、cGMP依賴蛋白磷酸化的級聯(lián)反應(yīng)、神經(jīng)元能量動力學(xué)和轉(zhuǎn)運體功能的調(diào)節(jié)均明顯參與這些過程。另外，激活2-腎上腺素能受體(2-adrenoceptor)、煙堿受體(nicotinic receptor)及purinergic receptor等可通過突觸前調(diào)節(jié) NO 釋放［6］。

3 nNOS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布

大腦內(nèi)nNOS含量最多。盡管腦血管和神經(jīng)膠質(zhì)細胞也含有nNOS，但以神經(jīng)元內(nèi)為主。大腦的很多區(qū)域都含nNOS神經(jīng)元，以小腦和副嗅球密度最高。

盡管nNOS神經(jīng)元約僅占大腦皮層神經(jīng)元的1%，實際上，皮層的每個神經(jīng)元均暴露在nNOS神經(jīng)末梢范圍內(nèi)。從形態(tài)學(xué)的觀點來看，nNOS神經(jīng)元在CNS的分布具有明顯的異質(zhì)性(heterogeneity)，即組成一個由不同的中間神經(jīng)元組成的群體。另外，nNOS神經(jīng)元的數(shù)目和化學(xué)特征依其所在的腦區(qū)不同而異，而同時該酶不與任何單一的神經(jīng)遞質(zhì)共存。nNOS或者位于突觸前或者突觸后，因而其與神經(jīng)元的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(neural signalling)、神經(jīng)毒性(neurotoxicity)、突觸可塑性(synaptic plasticity)及與行為有關(guān)的神經(jīng)通路的調(diào)節(jié)(如學(xué)習及痛覺)密切相關(guān)［6］。

所有的nNOS陽性神經(jīng)元都顯示-NADPH-黃遞酶活性，其已成為氮能神經(jīng)元(nitrergic neurone)的標志?？墒窃缙诘难芯拷Y(jié)果證實，這一結(jié)論可能受不正確的固定程序限制，應(yīng)小心對待［6］。

在CNS種，nNOS與興奮性氨基酸NMDA受體分布一致，這兩個系統(tǒng)存在密切聯(lián)系。NO首次被作為CNS中細胞間的信使是因為其介導(dǎo)谷氨酸受體激活而引起cGMP水平升高［6］。

4 NO在CNS的作用

4.1 NO參與突觸可塑性 NO作為逆行信使(retrograde messenger)協(xié)調(diào)兩種突觸可塑性強度，即長時程增強(long-term potentiation，LTP)和長時程減低(long-term depression，LTD)。LTP是很多中樞興奮型突觸(excitatory synapse)的特性，其特征是突觸傳遞(synaptic transmission)持續(xù)增強或突觸強度(synaptic strength)增加，可持續(xù)數(shù)小時、數(shù)周，甚至更長。誘發(fā)LTP的過程未完全了解，但涉及谷氨酸與amino-3-hydroxy-5-methylisooxazole-4-propionic acid(AMPA)或N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體的作用。這導(dǎo)致一系列事件的激活，如Ca2+/CaMKII、NOS及蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase)。LTP被認為是學(xué)習和記憶的突觸聯(lián)系(synaptic correlate)，最明確的是，在較高級的大腦中樞，LTP參與認知功能，尤其是在大腦皮質(zhì)(cerebral cortex)和海馬(hippocampus)。nNOS和神經(jīng)元內(nèi)存在的eNOS均參與LTP的形成，缺少這兩種酶的動物則表現(xiàn)出LTP降低。NO誘導(dǎo)LTP形成的主要效應(yīng)器是GC，但ADP核糖化作用(ADP-ribosylation)和鈣調(diào)蛋白激酶的激活均參與此過程［6］。

NO參與海馬LTP的早期階段。突觸后NO可通過激活GC，產(chǎn)生cGMP，然后激活PKG，PKG也是海馬LTP產(chǎn)生的重要分子，而 PKG抑制劑可抑制 LTP的產(chǎn)生。這樣，通過 NO-cGMP-PKG信號通路提高突觸傳遞，產(chǎn)生活性依賴性長時程遞質(zhì)釋放增加，誘導(dǎo)LTP產(chǎn)生［6］。

LTD是具有平行纖維突觸傳遞強度的持續(xù)減低，其在浦肯野細胞的爬行纖維受到重復(fù)興奮刺激后發(fā)生。突觸傳遞強度減弱源自突觸后AMPA受體敏感性降低，該受體介導(dǎo)蛋白激酶C(protein kinases C，PKC)、PKG和NO-cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。LTD在小腦中研究的最多，并把小腦中的LTD作為運動記憶的模型。但在大腦的較高級區(qū)域，也可觀察到LTD［6］。

4.2 NO參與CNS的功能 NO通過調(diào)節(jié)突觸的可塑性，對大腦發(fā)育、記憶和行為的形成具有復(fù)雜的影響。抑制NO合成，產(chǎn)生健忘癥(amnesia)、破壞空間學(xué)習(spatial learning)和嗅覺記憶(olfactory memory)，導(dǎo)致在被要求完成任務(wù)時行為遲緩及完成習慣任務(wù)的運動能力降低。NO參與視覺過程(visual processing)、辨別學(xué)習(discriminative learning)、吃喝行為(food and drinking behaviour)、溫度調(diào)節(jié)(thermoregulation)、阿片依賴和耐受(opiate tolerance and dependence)、晝夜節(jié)律(circadian rhythm)、睡眠和呼吸類型的產(chǎn)生過程。同樣地，由催產(chǎn)素能和5-羥色胺能通路(oxytocinergic and serotoninergic pathways)介導(dǎo)的行為反應(yīng)(behavioural response)被認為涉及NO的產(chǎn)生或中樞氮能神經(jīng)元受到刺激［6］。

4.3 nNOS與嗎啡 NO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮許多重要作用，包括調(diào)節(jié)嗎啡的作用。NO可拮抗嗎啡的止痛作用，在嗎啡依賴和耐受形成中起重要作用［9-12］。應(yīng)用非選擇性NOS拮抗劑N-硝基-L-精氨酸(N-nitro-L-arginine，NO2Arg)通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性強啡肽系統(tǒng)，使大腦多個腦區(qū)的內(nèi)源性強啡肽A水平升高，可緩解嗎啡身體依賴［11］和耐受［13］，并對嗎啡精神依賴具有部分逆轉(zhuǎn)作用［12］。L-精氨酸能易化嗎啡依賴、耐受及精神依賴形成。這些研究提示NO參與了嗎啡依賴、耐受及精神依賴的形成。

nNOS作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)含量最多的NOS，被認為是與藥物依賴關(guān)系密切的NOS。在嗎啡依賴和耐受大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)及受嗎啡長時程作用的SK-N-SH細胞株，均發(fā)現(xiàn)nNOS基因表達上調(diào)［14］。nNOS反義寡核苷酸可明顯緩解大鼠嗎啡戒斷和耐受，選擇性nNOS抑制劑7-硝基吲唑(7-nitroindazole，7-NI)逆轉(zhuǎn)嗎啡誘導(dǎo)的條件性位置偏愛(conditioned place preference，CPP)［15，16］。

NO作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)信息分子的發(fā)現(xiàn)急劇地改變了神經(jīng)元通訊的概念，NO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多重作用引起廣泛關(guān)注。nNOS表達增高參與了嗎啡依賴和耐受的形成，調(diào)節(jié)nNOS表達水平可能是緩解阿片類依賴和耐受的一種可能途徑。

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