P53和Ki-67蛋白在宮腔脫落細(xì)胞中的表達(dá)及意義

牛鳳霞 賈利剛 張俊琴 張為霞 黃黛

子宮內(nèi)膜癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，高發(fā)年齡為58～61歲，發(fā)生率占女性癌癥總數(shù)的7%，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，近年來(lái)隨著我國(guó)人均壽命的延長(zhǎng)，飲食結(jié)構(gòu)的改變，外源性激素治療，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，但有關(guān)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的機(jī)制尚不明確，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，愈后較差［1］。本文利用宮腔脫落細(xì)胞中細(xì)胞塊，用免疫組化法檢測(cè)正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生、子宮內(nèi)膜癌的P53蛋白表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)Ki-67在子宮內(nèi)膜發(fā)生發(fā)展中的作用，提高子宮內(nèi)膜癌的檢出率。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2006年6月至2009年5月，我院婦科門(mén)診患者108例，年齡35～78歲，平均年齡54.3歲;病例選擇陰道不規(guī)則出血、絕經(jīng)后出血、查體發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜增厚等。其中子宮內(nèi)膜癌32例，子宮內(nèi)膜不典型增生36例，正常子宮內(nèi)膜40例。

1.2 方法

1.2.1 取材方法:受檢者取膀胱截石位，碘伏消毒宮頸，將子宮內(nèi)膜細(xì)胞采集器在外套管的保護(hù)下，通過(guò)宮頸緩慢插入宮腔底部，讀出宮腔深度，回縮外套管推出采集器，順時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)動(dòng)3～5圈，將外套管向前推將采集器收入外套管中，連同一起退出宮腔，將采集環(huán)上的附著物立即投入液基小瓶中，做成液基薄層細(xì)胞涂片進(jìn)行觀察，剩余液體制成蠟塊。

1.2.2 標(biāo)本處理:將液基保存液瓶中的剩余液體(最好有肉眼可見(jiàn)的漂浮物)，以1500 r/min離心10 min，棄上清。0.9%氯化鈉溶液漂洗沉渣，以1000 r/min離心5 min，棄上清。加入4%甲醛，固定60 min，再以2000 r/min離心10 min，棄上清。加入60℃ 3%瓊脂攪勻，2000 r/min離心10 min。取出瓊脂塊，常規(guī)脫水、石蠟包埋。

1.2.3 HE染色及免疫組化染色法:細(xì)胞塊切成4 μm厚切片，常規(guī)HE染色，Ki-67、P53免疫組化染色，采用SP法，DAB顯色，即用型鼠抗人Ki-67、P53單克隆抗體，即用型SP試劑盒。

1.2.4 結(jié)果判定:P53、Ki-67蛋白表達(dá)為光學(xué)顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)明確的棕黃色顆粒細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)合半定量積分法［1］判斷蛋白表達(dá)結(jié)果，按染色強(qiáng)度打分，0分為無(wú)色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，鏡下選擇10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算其平均陽(yáng)性百分率，根據(jù)平均陽(yáng)性細(xì)胞的百分率分為4個(gè)等級(jí)，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞≤10%為1分，≤50%為2分，≤75%為3分，＞75%為4分，染色強(qiáng)度與平均陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積＞3定為免疫反應(yīng)陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

不同子宮內(nèi)膜組織中P53的表達(dá)分別為正常子宮內(nèi)膜7.5%(3/40)，子宮內(nèi)膜不典型增生 52.78%(19/36)，子宮內(nèi)膜癌87.5%(28/32)，3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=46.67，P＜0.01)，Ki-67在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生和子宮內(nèi)膜癌中的陽(yáng)性表達(dá)分別為5.00%(2/40)、55.56%(20/36)、90.6%(29/32)，3 組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=53.8，P＜0.01)。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌是女性生殖道最常見(jiàn)的惡性腫瘤。而對(duì)宮頸癌的早期篩查、早期診斷、早期治療已越來(lái)越受人們的重視，而且篩查方法也日趨完善，但對(duì)子宮內(nèi)膜癌的篩查及早診早治還沒(méi)有引起人們的足夠重視。往往臨床上一經(jīng)確診絕大部分已是Ⅰ期、Ⅱ期，甚至Ⅲ期，愈后較差，本研究旨在尋求一種篩查子宮內(nèi)膜癌，并利用免疫組化手段幫助診斷子宮內(nèi)膜病變。

以往診斷子宮內(nèi)膜癌最常用的方法是B型超聲檢查，對(duì)一些較典型的內(nèi)膜癌聲像圖診斷較明確，表現(xiàn)為子宮增大或絕經(jīng)后子宮相對(duì)增大，宮腔內(nèi)見(jiàn)實(shí)質(zhì)不均回聲區(qū)，形態(tài)不規(guī)則，宮腔線消失，宮腔鏡檢查，可直視宮腔，若有癌灶生長(zhǎng)能直接觀察癌灶大小、生長(zhǎng)部位、形態(tài)，并直視下取活檢送病理檢查。但最終靠診刮術(shù)是最常用最可靠的方法，刮出組織送病理檢查。但由于診刮術(shù)的局限性，不是每個(gè)患者都能刮出組織，而且是有創(chuàng)的，操作較繁瑣，痛苦大、出血多，患者不易接受，本研究使用的是子宮內(nèi)膜采集器，具有價(jià)廉、簡(jiǎn)單易行、無(wú)痛、出血少、器具一次性使用無(wú)交叉感染，準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)，門(mén)診大夫即可操作完成，特別是對(duì)一些有出血癥狀但內(nèi)膜又較薄，做診刮不易刮出組織的患者采取本方法彌補(bǔ)了這一不足。

P53基因蛋白是一種最常見(jiàn)的腫瘤抑制基因之一，野生型P53基因是通過(guò)停止細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其腫瘤抑制的功能，而突變型P53基因表達(dá)的蛋白可干擾野生型P53蛋白功能，因此突變型P53基因不僅喪失抑制活性反而具有促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化的活性細(xì)胞傾向與增殖、轉(zhuǎn)化和癌變。P53基因蛋白已被廣泛用于各種腫瘤的標(biāo)記，但用來(lái)標(biāo)記宮腔脫落細(xì)胞評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜病變研究者甚少［2］。

TCT與細(xì)胞塊技術(shù)已成為宮頸癌篩查的主要手段，但用于篩查子宮內(nèi)膜癌研究者甚少，TCT標(biāo)本制成細(xì)胞塊后，能將刷取的細(xì)胞盡可能地收集在一起，納入觀察范圍，細(xì)胞和細(xì)胞碎片經(jīng)離心制成石蠟切片后有相當(dāng)一部分可以形成組織學(xué)模式，在一定程度上可觀察到組織的結(jié)構(gòu)，經(jīng)HE染色后，鏡下接近組織學(xué)，背景清晰，細(xì)胞核漿更易觀察，同時(shí)再加免疫組化技術(shù)又彌補(bǔ)了細(xì)胞學(xué)診斷的局限性，本研究顯示，子宮內(nèi)膜癌中P53蛋白的表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜不典型增生，且3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，P53基因被認(rèn)為是惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展的主要原因，有研究表明突變型P53蛋白半衰期較野生型P53蛋白長(zhǎng)，能沉積在細(xì)胞核中，故突變的P53蛋白用免疫組化法可以檢測(cè)出來(lái)，因此可以將檢測(cè)率看做突變率，在一定程度上能預(yù)測(cè)內(nèi)膜癌的惡性程度，及早發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌或癌前病變。同時(shí)我們又檢測(cè)了Ki-67蛋白的表達(dá)，Ki-67蛋白是反應(yīng)細(xì)胞中增殖狀態(tài)的指標(biāo)，經(jīng)研究已證實(shí)，在惡性腫瘤細(xì)胞中常呈高表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)程度的高低反映了細(xì)胞增殖狀態(tài)，廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的增殖活性，本文研究發(fā)現(xiàn)Ki-67在子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生、正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)分別為90.6%、55.6%、5.00%，3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在某種程度上反映了Ki-67的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度與子宮內(nèi)膜病變的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

應(yīng)用P53和Ki-67免疫組化染色有助于子宮內(nèi)膜病變的準(zhǔn)確診斷，可作為診斷子宮內(nèi)膜病變的重要輔助指標(biāo)。同時(shí)又彌補(bǔ)了脫落細(xì)胞學(xué)診斷的局限性，盡管本研究數(shù)據(jù)有限，尚需大樣本研究證實(shí)，但畢竟為臨床大夫提供了有效信息，指導(dǎo)患者隨訪和治療，有望成為篩查子宮內(nèi)膜癌的輔助手段。

1 邢小芬，李曉，喬書(shū)花，等.子宮內(nèi)膜的內(nèi)分泌細(xì)胞及其內(nèi)分泌分化機(jī)制的探討.河北醫(yī)藥，2010，32:3542-3544.

2 Caye-Thomasen P，Larsen K，T ingsgaard P，et al.Immunoh is tochem ical demons-tration and sem i-quantitation of vascular endothelial growth factor in recurrent versus non-recurrent nasal polyps.Acta Otolaryngol，2004，124:706.