液相色譜－電噴霧離子肼質(zhì)譜聯(lián)用法在體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用＊

陳琴華，朱 軍，李 鵬

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 十堰 442008)

面對成分越來越復(fù)雜的分析樣品，以及痕量甚至超痕量水平的目標(biāo)分析物，如何能快速、準(zhǔn)確地獲取目標(biāo)分析物的信息，是樣品分析技術(shù)研發(fā)領(lǐng)域中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。近幾十年來，體內(nèi)藥物分析技術(shù)經(jīng)歷了常規(guī)分析、光譜法分析、色譜法分析、色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法分析等發(fā)展階段，不斷推動(dòng)著藥物代謝研究的發(fā)展[1]。高效液相色譜－電噴霧離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC－ESI/MSn)法是近年來迅速發(fā)展的一項(xiàng)高靈敏度、高專屬性、快速簡便的在線分離和檢測分析技術(shù)，適用于生物樣品的定性、定量分析，是藥物代謝物結(jié)構(gòu)分析最有效的測定方法之一。HPLC－ESI/MSn可在一級質(zhì)譜(MS)條件下獲得很強(qiáng)的待測物準(zhǔn)分子離子峰，幾乎不產(chǎn)生碎片離子，并且可借助MSn(n=2～10)對準(zhǔn)分子離子進(jìn)行多級裂解，進(jìn)而獲得豐富的結(jié)構(gòu)信息，因此其在生物樣品中的分析應(yīng)用越來越廣泛[2－3]。

1 概述

20世紀(jì)20年代，質(zhì)譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于分析領(lǐng)域。到了80年代，隨著快原子轟擊(FAB)、電噴霧(ESI)和基質(zhì)輔助激光解析(MALDI)等軟電離技術(shù)的出現(xiàn)，質(zhì)譜的分析性能得到了極大提高，離子阱質(zhì)譜儀是目前較成熟的質(zhì)譜儀之一，其主要優(yōu)點(diǎn)是能夠方便地進(jìn)行多級串聯(lián)質(zhì)譜(MSn)測量[4]。離子阱具有貯存離子和質(zhì)量分析功能，這決定了它具有離子－分子反應(yīng)很好的功效，離子阱中母離子與子離子共存，減少了傳輸損失，可更有效地檢測離子。離子阱作為串聯(lián)質(zhì)譜具有碰撞活化解離(CID)和激光解離(PD)功能，現(xiàn)在越來越多地應(yīng)用于化學(xué)分析領(lǐng)域中[5]。

HPLC－ESI/MSn結(jié)合了液相的高分離性能與作為檢測器的質(zhì)譜儀(MS)的高選擇性、高靈敏度，成為目前生物樣品中微量藥物和代謝物分析的實(shí)用方法[6]。許多化合物在中性環(huán)境中以中性分子被分析，然而，如果在有利于離子形成的情況下，其他化合物也能在有較高的靈敏度下分析。當(dāng)分析物溶解在酸或堿這樣的極性溶劑中時(shí)，它可被離子化或具有強(qiáng)的偶極矩。對于電離的分析物，電噴霧通常簡單且具有高靈敏度，不存在其他離子－離子相互作用的干擾，離子在噴霧之前已存在于溶液中，在噴霧中這些離子易從液滴中蒸發(fā)出來，得到較高的分析物離子豐度。形成強(qiáng)偶極矩但沒有被電離的分析物也可被分析，噴霧室中的強(qiáng)電場驅(qū)動(dòng)離子化過程，通過使用特定化學(xué)物質(zhì)的加合作用，這些分析物也可被化學(xué)電離[3－5]。

適合于電噴霧的樣品包括：含雜原子的樣品；通過引入可接受1個(gè)電荷的樣品；在溶液中能形成多電荷的樣品；在溶液中能形成離子的樣品；適用于熱噴霧的樣品；當(dāng)不能引入電荷時(shí)，避免極其非極性的樣品。電噴霧離子形成步驟包括：溶液中的電離(樣品的pKa和溶液的pH)；噴霧(表面張力、黏度和氣動(dòng)輔助)；去溶劑(干燥氣溫度、流速和熱容量)；離子從溶液中解吸(溶解能)；氣相中的離子化反應(yīng)(質(zhì)子親合力和電荷交換)。電噴霧離子化的影響因素有：溶液的化學(xué)性質(zhì)(流速、樣品pKa、溶液pH和溶液的導(dǎo)電性)；針的設(shè)置(內(nèi)部針的位置、針的狀況和噴霧壓力)；高電壓電極(毛細(xì)管和噴霧室電壓設(shè)置、毛細(xì)管和噴霧室高壓條件以及絕緣體的條件)。離子檢測極性和pH選擇的規(guī)則，正離子檢測為堿性樣品；降低pH；pH至少低于樣品pKa2個(gè)單位。負(fù)離子檢測為酸性樣品；增加pH；pH至少高于樣品pKa 2個(gè)單位。

2 應(yīng)用

藥物分析中，通過體內(nèi)(體液和組織)藥物的檢測可以了解給藥后藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄的情況，為藥物的藥效、毒性評價(jià)及其在體內(nèi)作用的機(jī)制研究提供信息。HPLC－ESI/MSn可使樣品的分離、定性和定量一次完成，并且靈敏度高，是藥物分析尤其是體內(nèi)藥物分析的一個(gè)重要手段。HPLC－ESI/MSn在體內(nèi)藥物分析中應(yīng)用較廣泛，主要涉及到化學(xué)藥物的血藥濃度測定和代謝產(chǎn)物鑒定、興奮劑和甾類的測定和鑒定，磷脂類藥物的測定、中藥活性化合物的測定和代謝產(chǎn)物的鑒定，以及其他如孔雀石綠、結(jié)晶紫和農(nóng)藥在體內(nèi)的殘留測定。見表1。

表1 HPLC－ESI/MSn在體內(nèi)化學(xué)藥物分析中的應(yīng)用

化學(xué)藥物的測定中，利培酮[7]、伊曲康唑[9]、偽麻黃堿、西替利嗪[16]和布比卡因[17]均采用選擇監(jiān)測離子監(jiān)測，為了提高靈敏度和專屬性，大多采用MS2離子監(jiān)測，如利培酮 m/z411→191和伊曲康唑 m/z 705.3→432.1，其檢測限分別達(dá)到0.1 ng/mL和1.0 ng/mL。對乙酰甲喹[8]、阿奇霉素[12]和莫西沙星[13]等進(jìn)行代謝物鑒定時(shí)，一般采用全離子掃描方式(SCAN)，并且可發(fā)揮離子肼質(zhì)譜的優(yōu)勢，采用一級全掃描(MS1)、二級全掃描(MS2)、多級全掃描(MSn)與一級選擇離子監(jiān)測、二級選擇離子監(jiān)測、多級選擇離子監(jiān)測相結(jié)合來鑒定相關(guān)代謝產(chǎn)物。

HPLC－ESI/MSn綜合了液相色譜和質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了各自的缺陷，因而具有靈敏度高、分析速度快和鑒別能力強(qiáng)的特點(diǎn)，可同時(shí)完成待測組分的分離和鑒定，特別適用于多組分混合物中未知組分的定性和定量分析，判斷化合物的分子結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確地測定化合物的分子量，是目前能夠?yàn)閜g級試樣提供結(jié)構(gòu)信息的工具。因此，HPLC－ESI/MSn可用于濫用藥物分析，主要包括毒物和精神類藥物，在毒品檢驗(yàn)、戒毒工作方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，可用于測定生物樣品和體液中藥物和代謝物的痕量分析。如可卡因、苯甲酰芽子堿和阿片制劑的測定[22]。根據(jù)國際奧委會(huì)醫(yī)學(xué)委員會(huì)的要求，體育運(yùn)動(dòng)中的興奮劑檢測能用作確認(rèn)的儀器是氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用和液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用。一般興奮劑檢測實(shí)驗(yàn)室都以氣相色譜－質(zhì)譜做初篩，一般用選擇離子檢測(SIM)即有較高的靈敏度，初篩有懷疑的樣品必須重新進(jìn)行檢測，并用樣品與同樣條件下比對物全掃描質(zhì)譜圖的一致性、保留時(shí)間的一致性對檢測物質(zhì)進(jìn)行定性，而離子肼質(zhì)譜具有多級解離和裂解功能，可對確證這類化合物提供有利的幫助。如皮質(zhì)激素類藥物、麻黃堿、沙丁胺醇和嗎啡[21]以及甾類藥物的分析[23]。

電噴霧是常見的軟電離質(zhì)譜技術(shù)，電噴霧離子阱質(zhì)譜檢測為天然產(chǎn)物的成分分析提供了簡便、靈敏的方法。一方面，軟電離技術(shù)不會(huì)破壞天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)；另一方面，強(qiáng)大的MSn功能可以反復(fù)篩選目標(biāo)離子，排除其他干擾離子，結(jié)合MSn的離子源碰撞誘導(dǎo)解離可從化合物的斷裂規(guī)律初步解析天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和中藥活性化合物的代謝產(chǎn)物。如對水蘇堿[22]、大豆黃素[26]和藥根堿[27]等的研究均采用了MSn分析，確認(rèn)其代謝途徑和相關(guān)代謝產(chǎn)物。其他還可運(yùn)用如對魚肉中孔雀石綠和結(jié)晶紫[33]和人血漿中大量農(nóng)藥殘留的研究[34]。

3 展望

基于質(zhì)譜的代謝組學(xué)分析，主要采用液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC－MS)和氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC－MS)。氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)雖因具有解析能力強(qiáng)、靈敏度高、擁有成熟的商業(yè)化質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫等多方面優(yōu)勢，在代謝組研究中得到一定的應(yīng)用，但在代謝組學(xué)分析中的主要對象為血清、尿液等體液和組織勻漿液，這些生物樣品在分析前需要預(yù)處理，包括蛋白沉淀、代謝物提取等步驟。由于氨基酸、有機(jī)酸等重要的內(nèi)源性代謝物揮發(fā)性較弱，且具有熱不穩(wěn)定性，必須進(jìn)行衍生化后才能運(yùn)用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析。而液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)不需要衍生化，適合分離測定大部分化合物，應(yīng)用前景會(huì)越來越廣泛。高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已成為目前生物樣品中微量藥物和代謝物分析的常用方法。離子阱能方便地進(jìn)行多級串聯(lián)質(zhì)譜測量，從而獲得豐富的結(jié)構(gòu)信息，具有不可比擬的高靈敏度和選擇性。因此，HPLC－ESI/MSn在藥物代謝產(chǎn)物的鑒定方面應(yīng)用會(huì)越來越廣泛。

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