不同提取條件對草莓果實抗氧化物質(zhì)和抗氧化活性的影響

羅 婭，王小蓉，張 勇，劉澤靜，任云南，楊 濤，湯浩茹

(四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院，四川 雅安 625014)

不同提取條件對草莓果實抗氧化物質(zhì)和抗氧化活性的影響

羅 婭，王小蓉，張 勇，劉澤靜，任云南，楊 濤，湯浩茹*

(四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院，四川 雅安 625014)

以草莓栽培品種“豐香”(Fragaria ananassa)綠熟階段的果實為試材，研究提取試劑、溫度、時間對草莓果實抗氧化物質(zhì)和抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，甲醇-水-鹽酸(體積比80∶19.9∶0.1)提取物中總酚、類黃酮、抗壞血酸，DPPH自由基清除能力和鐵還原氧化能力顯著高于甲醇、乙醇、甲醇-乙醇-丙酮體積比(1∶1∶1)和水的提取物。然而，抗氧化物質(zhì)提取的最佳條件(60℃，480min)與獲得最高抗氧化活性的提取條件(25℃，120min)并不一致，說明抗氧化物質(zhì)含量的高低并不總是草莓果實提取物抗氧化活性強弱的指示劑。綜合抗氧化物質(zhì)的提取量以及提取物的抗氧化活性，甲醇-水-鹽酸(體積比 80∶19.9∶0.1)在25℃進行120min草莓果實抗氧化物質(zhì)的提取更為適合。

草莓；果實提取物；提取劑；抗氧化物質(zhì)；抗氧化活性

氧化損傷被認為是導致人類癌癥和心臟病等慢性疾病發(fā)生的主要原因之一[1]。大量研究表明，蔬菜和水果的食用有助于降低人類患慢性疾病的可能[2-3]，其根本原因在于蔬菜和水果中含有豐富的抗氧化物質(zhì)[4-5]，從而能保護細胞抵御自由基的攻擊，減輕氧化損傷。

草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是一種美觀、可口且富含抗壞血酸、多酚類物質(zhì)、鉀、纖維、單糖和其他次級代謝產(chǎn)物的水果[6-7]，其抗氧化能力是蘋果、桃、梨、番茄、柑橘和獼猴桃等園藝產(chǎn)品的2～11倍[8-10]。在草莓成熟過程中，又以綠熟期(坐果后約7～20d)的草莓果實抗氧化能力最強[11-12]。然而在生產(chǎn)中為保證草莓品質(zhì)，多余的綠熟期小果將被疏掉，從而產(chǎn)生大量農(nóng)業(yè)廢棄物。從環(huán)保觀點來看，對農(nóng)業(yè)和食品行業(yè)中植物廢棄物的再次利用是目前發(fā)展的新趨勢，若能對廢棄的綠熟期草莓果實進行天然抗氧化物質(zhì)的開發(fā)將在生產(chǎn)實踐上發(fā)揮重要作用。

目前植物抗氧化物質(zhì)的提取多采用溶劑抽提的方法，其根本原因在于方法簡單和成本較低[13]。水、甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯以及有機溶劑與水的混合物是常用的提取試劑[14-17]。在提取過程中，提取時間、pH值、溫度以及抗氧化物質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)也影響著植物抗氧化物質(zhì)的提取效率[18-19]，因此探尋較優(yōu)的提取體系從而獲得更高抗氧化活性的提取物是非常必要的。目前，草莓果實抗氧化方面的研究多集中在不同品種抗氧化能力大小和抗氧化物質(zhì)的組成上[8-12]，有關(guān)草莓果實抗氧化物質(zhì)的提取體系還未見報道。因此，本實驗以綠熟期草莓果實為試材，探討提取試劑、溫度和時間等主要因素對其抗氧化物質(zhì)和抗氧化活性的影響，從而獲取草莓果實抗氧化物質(zhì)較優(yōu)的提取體系，以期為進一步開發(fā)利用廢棄的草莓果實提供一定參考。

1 材料與方法

“豐香”(Fragaria ananassa)綠熟期的草莓果實。于2010年4月取自四川農(nóng)業(yè)大學教學科研園區(qū)大棚內(nèi)，采后立即運回實驗室，選擇大小一致，無病蟲害，無損傷的果實為試材，用液氮速凍并研磨成粉后，貯于-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 溶劑抽提

稱取0.15g來自30個果實的混合樣品分別溶于3mL的甲醇、乙醇、水、甲醇-乙醇-丙酮混合液(體積比1∶1∶1)以及甲醇-水-鹽酸混合液(體積比80∶19.9∶0.1)中，充分振蕩后分別放于25℃和60℃密閉的試管中水浴60、120、480min。水浴后10000×g高速冷凍離心10min，取上清液立即進行抗氧化活性與抗氧化物質(zhì)含量的測定。

1.2.2 總酚的測定

總酚物質(zhì)含量的測定按照Folin-Denis法[20]，取1mL提取液于Eppendorf管中，分別加入0.5mL福林酚，3mL 2% Na2CO3溶液，室溫避光2h后，以抽提試劑為對照。用紫外分光光度計測定765nm波長處的吸光度，計算總酚含量，以mg/100g的沒食子酸為標準物。

1.2.3 類黃酮的測定

參照王霄霄[21]的方法，略作修改。取0.1mL提取液于Eppendorf管中，先后加入0.3mL 8% NaNO2溶液，反應(yīng)6min，0.3mL 10% Al(NO3)3溶液，反應(yīng)6min，2.0mL 2mol/L NaOH溶液，4.9mL乙醇，混勻靜置10min后，10000×g離心10min，收集上清液，以提取試劑為對照，用紫外分光光度計測定510nm波長處的吸光度，計算類黃酮含量，以mg/100g的蘆丁為標準物。

1.2.4 抗壞血酸的測定

參照孫園園[22]的方法，略作修改。取0.3mL上清液，加入0.75mL含5mmol/L EDTA的磷酸緩沖液(150mmol/L，pH7.4)和0.15mL 10mmol/L DTT。室溫放置10min后，加入0.15mL 0.5% N-乙基馬來酰亞胺以消除多余的DTT。然后加入0.6mL 10% 三氯乙酸，0.6mL 44%正磷酸溶液，0.6mL 4%雙吡啶酒精(70%)溶液和0.15mL 0.3% FeCl3溶液?；靹蚝?0℃水浴40min，測定525nm處的吸光度，計算抗壞血酸含量，以mg/100g的抗壞血酸為標準物。

1.2.5 FRAP(ferric reducing antioxidant power，鐵還原氧化能力)法測定抗氧化能力

參照楊冬梅等[20]的方法，取20μL上清液，加入1.8mL TPTZ工作液(由0.3mol/L 醋酸鹽緩沖液25mL，10mmol/L TPTZ溶液2.5mL，20mmol/L FeCl3溶液2.5mL組成)，混勻后37℃反應(yīng)30min，測定593nm波長處的吸光度。以1.0mmol/L FeSO4為標準，樣品抗氧化活性(FRAP值)以達到同樣吸光度所需的FeSO4的毫摩爾數(shù)表示。

1.2.6 DPPH(1,1-diphebyl-2-picrylhydrazyl，1,1-二苯代苦基苯肼)自由基清除率的測定

參照楊冬梅等[20]的方法，略作修改。將2.8mL 60μmmol/L DPPH-乙醇溶液與20μL上清液混合，30min后測定反應(yīng)液在517nm波長處的吸光度，對照以80%乙醇代替樣品。DPPH自由基清除率計算公式：

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標準差”(n=3)表示，并進行顯著性檢驗(P≤0.05)，實驗重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠熟期草莓果實提取物抗氧化物質(zhì)含量

綠熟期草莓果實抗氧化物質(zhì)的提取量隨提取試劑、提取時間和溫度有所差異，其中提取試劑的影響最大(表1)。在5種提取試劑中，甲醇-水-鹽酸(體積比80∶19.9∶0.1)是草莓果實總酚最有效的提取試劑，其次是甲醇、甲醇-乙醇-丙酮(體積比1∶1∶1)、乙醇和水。5種提取試劑在60℃條件下總酚的提取量較25℃高，然而提取時間對總酚提取量的影響并沒有表現(xiàn)出規(guī)律性的變化。從表1分析得出，甲醇-水-鹽酸溶液(80∶19.9∶0.1)在60℃，480min的條件下，總酚提取量最多(1058mg/100g)，是相同條件下其他4種提取試劑的1.15～2.14倍。

表1 綠熟期草莓果實提取物抗氧化物質(zhì)含量Table 1 Contents of total phenols, flavonoids and ascorbic acid in different solvent extracts from strawberry fruits

提取物中包括類黃酮在內(nèi)的酚類物質(zhì)和抗壞血酸等抗氧化物質(zhì)。在25℃時，類黃酮在甲醇溶液中的提取效果最好，提取量在13.93～15.83mg/100g之間，其次是甲醇-水-鹽酸(8.73～11.29mg/100g)，甲醇-乙醇-丙酮(6.35～11.96mg/100g)，乙醇(6.80～7.96mg/100g)和水(2.92～3.96mg/100g)。提取時間(60～480min)對類黃酮提取量的影響也無規(guī)律性的變化，除水在60min時獲得較高含量的類黃酮提取物外，其余4種提取試劑均在120min時獲得較高含量的類黃酮。在60℃時，草莓果實類黃酮的提取量幾乎均高于在25℃時的提取量，除甲醇-乙醇-丙酮(1∶1∶1)外，其他4種提取試劑均在60℃，480min的條件下獲得最高含量的類黃酮。在此條件下，又以甲醇-水-鹽酸溶液(80∶19.9∶0.1)的提取效果最好(25.37mg/100g)，是其他4種提取試劑類黃酮提取量的1.35～2.79倍。

在抗壞血酸的提取過程中，仍然是甲醇-水-鹽酸溶液(80∶19.9∶0.1)的提取效果最好。溫度對抗壞血酸的提取效果影響較大，25℃比60℃更適合抗壞血酸的提取(表1)。在60℃、480min的條件下，甲醇-水-鹽酸溶液(80∶19.9∶0.1)對抗壞血酸的提取量僅有13.68mg/100g，而在25℃，120min的條件下，甲醇-水-鹽酸溶液(80∶19.9∶0.1)對抗壞血酸的提取量達到最大值31.15mg/100g。比較草莓果實提取物抗氧化物質(zhì)的含量發(fā)現(xiàn)，提取物中總酚含量遠遠高于類黃酮與抗壞血酸的含量(表1)，認為總酚是草莓果實提取物中主要的抗氧化物質(zhì)。

2.2 綠熟期草莓果實提取物抗氧化活性

DPPH和FRAP法是廣泛用于測定果蔬抗氧化能力的兩種方法。本實驗采用這兩種方法來探討綠熟期草莓果實提取物的抗氧化活性，所有提取物均表現(xiàn)出抗氧化活性，并且兩種方法的測定結(jié)果具有一致性(表2)。當提取條件在25℃，120min時，甲醇-水-鹽酸(80∶19.9∶0.1)提取物表現(xiàn)出最強的DPPH自由基清除能力(71.25%)和鐵還原氧化能力(0.36mmol/100g)，乙醇提取物的抗氧化能力最弱，DPPH自由基清除能力和鐵還原氧化能力僅有甲醇-水-鹽酸(80∶19.9∶0.1)提取物的28.53%和30.56%。甲醇-水-鹽酸(80∶19.9∶0.1)提取物的抗氧化活性對溫度非常敏感，當提取溫度在60℃時，DPPH自由基清除能力和鐵還原氧化能力幾乎均低于25℃時的抗氧化活性，而其他4種提取試劑的提取物幾乎隨提取溫度和時間的增加其抗氧化活性也隨著增加。然而，從表1分析得出，仍然是25℃、120min時，甲醇-水-鹽酸溶液(80∶19.9∶0.1)的提取物抗氧化活性最強。

表2 綠熟期草莓果實提取物抗氧化活性Table 2 Antioxidant activities of different solvent extracts from strawberry fruits

3 討 論

溶劑極性對植物抗氧化物質(zhì)的提取有著較大的影響。由于不同溶劑對植物抗氧化物質(zhì)的溶解能力不同，從而導致提取物中抗氧化物質(zhì)含量顯著不同，因此選擇適當?shù)奶崛≡噭┦谦@得高含量抗氧化物質(zhì)的重要因素之一。本實驗選用幾種較為常用的提取試劑對綠熟期草莓果實抗氧化物質(zhì)進行提取，研究表明，總酚是草莓果實提取物中主要的抗氧化物質(zhì)，并且甲醇-水-鹽酸(80∶19.9∶0.1)是總酚提取較為適合的提取溶劑，甲醇、甲醇-乙醇-丙酮(1∶1∶1)、乙醇和水的效果次之(表1)。Gonzalez-Montelongo等[18]研究認為水提取物總酚含量低的原因可能是由于多酚氧化酶氧化酚類化合物所致，而含有甲醇或乙醇的溶液則抑制了多酚氧化酶的活性，從而提取物中總酚含量較高。

提取時間對綠熟期草莓果實抗氧化物質(zhì)提取的影響并沒有表現(xiàn)出規(guī)律性的變化，而溫度卻有著明顯的影響。在25℃時更適合抗壞血酸的提取，而在60℃時則更有利于總酚和類黃酮的提取。這在葡萄皮、楊桃和香蕉皮抗氧化物質(zhì)的提取過程中也有類似的報道[23-25]。大量研究認為，溫度升高有助于提高溶劑的提取效率，其原因主要是擴散系數(shù)和溶劑中提取物的溶解性增大所致[18,26-27]。然而，并不是所有抗氧化物質(zhì)的提取效率均在高溫下更高。柑橘皮中酚類化合物含量并沒有隨提取溫度的升高(40～100℃)而增加[28]。Liyana-Pathirana等[29]研究認為，在高溫下，熱穩(wěn)定的抗氧化物質(zhì)的提取速度高于難溶的抗氧化物質(zhì)的降解速度是提取效率增加的主要原因。因此，只有含有較高比例熱穩(wěn)定的抗氧化物質(zhì)樣品才更適合在高溫下進行抗氧化物質(zhì)的提取[23]。

為獲得較好的提取體系，提取物的抗氧化活性在本實驗中也進行了測定與分析。提取物的抗氧化活性在不同溶劑和提取條件下顯著不同，說明提取物中存在不同極性的抗氧化物質(zhì)[18]。在實驗中還觀察到，抗氧化物質(zhì)提取的最佳條件與獲得最高抗氧化活性的提取條件并不一致，并且相關(guān)性分析表明，總酚含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性較弱。這在黑糯米[13]、茜草科植物[26]和蕎麥[16]抗氧化物質(zhì)的提取研究中也有類似的結(jié)論。高含量的酚類化合物并沒有表現(xiàn)出高的抗氧化活性，其原因主要是：第一，抗氧化活性的高低不僅受總酚含量的影響，也受酚類物質(zhì)化學結(jié)構(gòu)的影響[13,30]；第二，抗氧化物質(zhì)的協(xié)同作用有可能削弱酚類物質(zhì)與抗氧化活性之間的相關(guān)性[13,26]。因此，總酚含量的高低并不總是草莓果實提取物抗氧化活性強弱的指示劑。

小綠階段草莓果實中含有豐富的抗氧化物質(zhì)[11-12]。甲醇-水-鹽酸(80∶19.9∶0.1)是草莓果實抗氧化物質(zhì)提取較為適合的提取劑，不僅可以獲得高含量的抗氧化物質(zhì)，而且抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性較高。綜合抗氧化物質(zhì)的提取量以及提取物的抗氧化活性，甲醇-水-鹽酸(80∶19.9∶0.1)在25℃、120min條件下進行草莓果實抗氧化物質(zhì)的提取更為適合。

[1]ZHANG Yanjun, SEERAM N P, LEE R, et al. Isolation and identification of strawberry phenolics with antioxidant and human cancer cell antiproliferative properties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(3)∶ 670-675.

[2]DRAGSTED L O, STRUBE M, LARSEN J C. Cancer-protective factors in fruits and vegetables∶ biochemical and biological background [J]. Pharmacol Toxicol, 1993, 72(1)∶ 116-135.

[3]VERLANGIREI A J, KAPEGHIAN J C, El-DEAN S, et al. Fruit and vegetable consumption and cardiovascular mortality[J]. Med Hypoth, 1985, 16(1)∶ 7-15.

[4]KRIS-EEHERTON P M, HECKER K D, BONANOME A, et al. Bioactive compounds in foods∶ their role in the prevention of cardiovascular disease and cancer[J]. American Journal of Medicine, 2002, 113 (9)∶ 71-88.

[5]RUXTON C, GARDNER E, WALKER D. Can pure fruit and vegetable juices protect against cancer and cardiovascular disease too? A review of the evidence[J]. International Journal of Food Science and Nutrition, 2006, 57(3/4)∶ 249-272.

[6]PEREZ A G, OLIAS R, ESPADA J, et al. Rapid determination of sugars, nonvolatile acids, and ascorbic acid in strawberry and other fruits [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997, 45(9), 3545-3549.

[7]WANG S Y, GALLETTA G J. Compositional change in Colletotrichum (Anthracnose) infected strawberry fruit[J]. Acta Horticulturae, 2002, 567∶815-819.

[8]SILVIA T, ELENA D I, DAMIANO R, et al. Antioxidant capacity, ascorbic acid, total phenols and carotenoids changes during harvest and after storage of Hayward kiwifruit[J]. Food Chemistry, 2008, 107(1)∶282-288.

[9]WANG hong, CAO Guohua , PRIOR R L. Total antioxidant capacity of fruits[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1996, 44(3)∶ 701-705.

[10]MEYERS K J, WATKINS C B, PRITTS M P, et al. Antioxidant and antiproliferative activities of strawberries[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(23)∶ 6887-6892.

[11]WANG S Y, LIN H S. Antioxidant activity in fruits and leaves of blackberry, raspberry, and strawberry varies with cultivar and development stage[J]. J Agric Food Chem, 2000, 48(2)∶ 140-146.

[12]FERREYRA R M, VINA S Z, MURIDGE A, et al. Growth and ripening season effects on antioxidant capacity of strawberry cultivar Selva[J]. Scientia Horticulturae, 2007, 112(1)∶ 27-32.

[13]TANANUWONG K, TEWARUTH W. Extraction and application of antioxidants from black glutinous rice[J]. LWT-Food Science and Technology, 2010, 43(3)∶ 476-481.

[14]LAFKA T I, SINANOGLOU V, LAZOS E S. On the extraction and antioxidant activity of phenolic compounds from winery wastes[J]. Food Chemistry, 2007, 104(3)∶ 1206-1214.

[15]SHUI G, LEONG L P. Residue from star fruit as valuable source for functional food ingredients and antioxidant nutraceuticals[J]. Food Chemistry, 2006, 97(2)∶ 277-284.

[16]SUN T, HO C. Antioxidant activities of buckwheat extracts[J]. Food Chemistry, 2005, 90(4)∶ 743-749.

[17]NAM S H, CHOI S P, KANG M Y, et al. Antioxidative activities of bran extracts from twenty one pigmented rice cultivars[J]. Food Chemistry, 2006, 94(4)∶ 613-620.

[18]GONZALEZ-MONTELONGO R, LOBO M G, GONZALEZ M. Antioxidant activity in banana peel extracts∶ testing extraction conditions and related bioactive compounds[J]. Food Chemistry, 2010, 119(3)∶1030-1039.

[19]AWIKA J M, ROONEY L W, WANISKA R D. Anthocyanins from sorghum and their antioxidant properties[J]. Food Chemistry, 2005, 90 (1/2)∶ 293-301.

[20]楊冬梅, 金月亭, 柯樂芹, 等. 12種常見蔬菜抗氧化活性的比較研究[J]. 中國食品學報, 2007, 7(5)∶ 24-29.

[21]王霄霄. 不同品種楊梅果實品質(zhì)和抗氧化活性的比較[D]. 杭州∶ 浙江大學, 2007.

[22]孫園園. 氮素營養(yǎng)對菠菜體內(nèi)抗壞血酸含量及其代謝的影響[D]. 杭州∶ 浙江大學, 2008.

[23]PINELO M, RUBILAR M, JEREZ M, et al. Effect of solvent temperature and solvent-to-solid ratio on the total phenolic content and antiradical activity of extracts from different components of grapepomace[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(6)∶ 2111-2117.

[24]SHUI G H, LEONG L P. Residue from star fruit as valuable source for functional food ingredients and antioxidant nutraceuticals[J]. Food Chemistry, 2006, 97(2)∶ 277-284.

[25]GONZALEZ-MONTELONGO R, LOBO M G, GONZALEZ M. The effect of extraction temperature, time and number of steps on the antioxidant capacity of methanolic banana peel extracts[J]. Separation and Purification Technology, 2010, 71(3)∶ 347-355.

[26]THPP Y Y, HO S K, LIANG J Y, et al. Effects of binary solvent extraction system, extraction time and extraction temperature on phenolic antioxidants and antioxidant capacity from Mengkudu (Morinda citrifolia)[J]. Food Chemistry, 2010, 120(1)∶ 290-295.

[27]AL-FARSI M A, LEE C Y. Optimization of phenolics and dietary fiber extraction from date seed[J]. Food Chemistry, 2008, 108(3)∶ 977-985.

[28]XU G H, CHEN J C, LIU D H, et al. Minerals, phenolic compounds, and antioxidant capacity of citrus peel extract by hot water[J]. Journal of Food Chemistry, 2008, 73(1)∶ 11-18.

[29]LIYANAI-PATHIRANA C, SHAHIDI F. Optimization of extraction of phenolic compounds from wheat using response surface methodology[J]. Food Chemistry, 2005, 93(1)∶ 47-56.

[30]OZSOY N, YILMAZ T, KURT O, et al. In vitro antioxidant activity of Amaranthus lividus L[J]. Food Chemistry, 2009, 116(4)∶ 867-872.

Effect of Extraction Conditions on Antioxidant Components and Antioxidant Activity of Strawberry Fruit Extracts

LUO Ya，WANG Xiao-rong，ZHANG Yong，LIU Ze-jing，REN Yun-nan，YANG Tao，TANG Hao-ru*
(College of Horticultural, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

Strawberry fruits from Fragaria ananassapicked at the green maturity stage were extracted with different solvents under varying conditions of temperature and extraction time and the extracts obtained were tested for their antioxidant components and antioxidant activity. The results showed that methanol-water-HCl (80∶19.9∶0.1, V/V) extract revealed a significant increase in the contents of total phenols, flavonoids and ascorbic acid, DPPH free radical scavenging activity and ferric ions reducing power when compared with methanol, ethanol, methanol∶ ethanol-acetone (1∶1∶1, V/V) and water extracts. The optimal extraction conditions (at 60 ℃ for 480 min) for achieving maximum extraction of antioxidant components did not accord with those (at 25 ℃ for 120 min) resulting in maximum antioxidant activity, indicating that the contents of antioxidant components did not necessarily represent the antioxidant activity of strawberry fruit extracts. Comprehensively considering the contents of antioxidant components and antioxidant activity of strawberry fruit extracts, we concluded that extraction with methanol-water-HCl mixture (80∶19.9∶0.1, V/V) for 120 min at 25 ℃ is more suitable for extracting antioxidant components from Strawberry fruits.

strawberry；fruit extract；extraction solvent；antioxidant component；antioxidant activity

S668.4

A

1002-6630(2011)14-0108-05

2010-09-27

四川省教育廳重點項目(07ZZ023；09ZB050)；四川農(nóng)業(yè)大學“雙支計劃”項目(06370501)

羅婭(1979—)，女，副教授，博士，主要從事果樹生物技術(shù)研究。E-mail：luoya945@163.com

*通信作者：湯浩茹(1963—)，男，教授，博士，主要從事果樹生物技術(shù)研究。E-mail：htang@sicau.edu.cn