豆粕固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化及發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

吳逸飛 姚曉紅 王 新 孫 宏 錢 彬 張 博 湯江武

豆粕固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化及發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

吳逸飛 姚曉紅 王 新 孫 宏 錢 彬 張 博 湯江武

以小肽含量為指標(biāo)篩選出一株用于固態(tài)發(fā)酵豆粕的枯草芽孢桿菌（BSW-2），并對工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，最后通過變性梯度凝膠電泳技術(shù)（PCR-DGGE）探討了發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的變化。結(jié)果表明：最佳工藝條件為接種量0.5%，料水比1：1.2，發(fā)酵溫度35℃，發(fā)酵時間36 h。在此條件下，發(fā)酵豆粕小肽含量從11.52mg/g提高到202.20mg/g，粗蛋白含量從47.65%提高到55.63%。PCR-DGGE結(jié)果表明，菌株BSW-2在整個發(fā)酵體系中均占有絕對優(yōu)勢。

豆粕；枯草芽孢桿菌；固體發(fā)酵；小肽；PCR-DGGE；細(xì)菌群落

吳逸飛，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物所，310021，浙江杭州。

姚曉紅、王新、孫宏、湯江武（通訊作者），單位及通訊地址同第一作者。

錢彬，衢州出入境檢驗(yàn)檢疫局。

張博，株洲智薈生物科技有限公司。

豆粕是大豆經(jīng)浸提脫油后的碎片狀或粗粉狀的副產(chǎn)品，其粗蛋白含量高，氨基酸組成合理，是目前使用最多、最廣泛的植物性蛋白質(zhì)飼料原料[1-2]。肽是蛋白質(zhì)降解的中間產(chǎn)物，由2個或2個以上的氨基酸以肽鍵相連。相對分子量在1～2 kD之間的肽稱為小肽[3]。大豆肽是大豆蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶水解后得到的肽類混合物，以3～8個氨基酸組成的小肽為主。其氨基酸組成與大豆蛋白質(zhì)相同，必需氨基酸含量豐富。大豆肽與大豆蛋白質(zhì)相比，大豆肽消化吸收率較高，提供能量迅速，某些有生理活性的肽直接被動物吸收利用后，還具有免疫、神經(jīng)遞質(zhì)、抗氧化等活性[4-7]。動物采食的蛋白質(zhì)經(jīng)消化酶降解成游離氨基酸和各種小肽，游離氨基酸可以被動物直接吸收利用，而完整蛋白質(zhì)或其降解產(chǎn)生的小肽也能被動物直接吸收，小肽具有與單個氨基酸不同的吸收機(jī)制，比單個氨基酸的吸收更有效[8-13]。

變性梯度凝膠電泳技術(shù)（PCR-DGGE）是一種根據(jù)DNA堿基序列的不同，在含有變性梯度的聚丙烯酰胺凝膠中將具有相同分子量的DNA分開的技術(shù)。選取細(xì)菌16S rDNA的V3區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將PCR產(chǎn)物用于變性梯度凝膠電泳，電泳圖譜中的一個條帶就代表一個微生物物種，亮度代表該物種在整個環(huán)境中的含量[14-17]。

本研究擬篩選出具有較強(qiáng)蛋白降解能力細(xì)菌，并對其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，使豆粕中的大分子蛋白得到較大程度的降解，提高小分子肽類的含量，最終提高豆粕的利用率和營養(yǎng)價值，同時采用PCR-DGGE方法分析豆粕發(fā)酵體系中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

豆粕：紹興中大生物科技有限公司提供，去皮豆粕，粗蛋白≥45%。

菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）12株，分別用 F3-1、F4、B1、BS1、BS2、BSIF、BSW-2、Ndt、KA、KB、ZCS、NBS表示，均為實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g、水 1000m l，pH 值 7.0。

牛奶培養(yǎng)基：脫脂奶粉50 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，水 1000ml，pH 值 7.0。

1.3 方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌的篩選

將本實(shí)驗(yàn)室保藏的12株枯草芽孢桿菌從甘油管取出，劃線于LB平板上，30℃培養(yǎng)24 h，待單菌落長出，挑單菌落接種于試管斜面，30℃培養(yǎng)24 h，于4℃保存。利用透明圈法篩選產(chǎn)蛋白酶菌株，將活化好的單菌落點(diǎn)種于牛奶培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h，可以觀察到明顯的水解透明圈，記錄下透明圈直徑和菌落的直徑。

將透明圈法篩選得到的菌株進(jìn)行復(fù)篩，從試管斜面刮取1環(huán)接入20ml液體LB培養(yǎng)基，在30℃、160 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)12 h，制成種子液；將種子液用于豆粕固體發(fā)酵，罐頭瓶裝料量100 g/瓶（干重），豆粕：水＝1：1.0，接種量2%，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵48 h，發(fā)酵結(jié)束后將樣品于50℃烘干，粉碎過80目篩，測定小肽含量。

1.3.2 液體種子的制備

枯草芽孢桿菌經(jīng)斜面活化后刮取一環(huán)接入20ml液體LB培養(yǎng)基，在30℃、160 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)12 h，制成種子液。

1.3.3 豆粕基礎(chǔ)發(fā)酵方法

豆粕基礎(chǔ)菌酶協(xié)同處理條件為裝料量100 g/瓶、BSW-2接種量1%、料水比1：1、發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間48 h基礎(chǔ)上，豆粕以一定比例加水，接種，混合均勻后裝入罐頭瓶中，用8層紗布加報紙封口，放入培養(yǎng)箱中，設(shè)定溫度，在試驗(yàn)設(shè)定的時間取出，50℃烘干，粉碎，過80目篩待測。

1.3.4 枯草芽孢桿菌豆粕發(fā)酵單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 接種量對小肽含量的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵條件上，控制其他因素不變，分別接種0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%的 BSW-2菌液進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束經(jīng)烘干、粉碎后測定小肽含量。

1.3.4.2 料水比對小肽含量的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵條件上，控制其他因素不變，分別按料 水 比 1： 0.6、1： 0.8、1： 1、1： 1.2、1： 1.4、1： 1.6、1：1.8加水進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束經(jīng)烘干、粉碎后測定小肽含量。

1.3.4.3 發(fā)酵溫度對小肽含量的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵條件上，控制其他因素不變，分別設(shè)定 30、35、40、45、50 ℃的溫度進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束經(jīng)烘干、粉碎后測定小肽含量。

1.3.4.4 發(fā)酵時間對小肽含量的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵條件上，控制其他因素不變，分別設(shè)定 0、12、24、36、48、60、72 h 的時間進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束經(jīng)烘干、粉碎后測定小肽含量。

1.3.5 枯草芽孢桿菌豆粕發(fā)酵工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計4因素3水平L9（34）的正交試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化。發(fā)酵結(jié)束經(jīng)烘干、粉碎后測定小肽、粗蛋白含量，氨基酸組成分析，聚丙烯酰胺變性凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。

1.3.6 PCR-DGGE方法分析豆粕發(fā)酵

1.3.6.1 樣品制備

裝料量100 g/瓶、BSW-2接種量1%、料水比1：1、發(fā)酵溫度 30 ℃分別在 0、12、18、24、30、36、42、48 h 的時間點(diǎn)處取樣裝入無菌封口袋中，-20℃保存待用。

1.3.6.2 細(xì)菌總DNA的提取及16SV3區(qū)PCR擴(kuò)增

采用本實(shí)驗(yàn)發(fā)明的方法提取豆粕樣品中細(xì)菌總DNA，采用上游引物GC+341(5'-CGCCCGCCGCGCG CGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGG AGGCAGCAG-3')下游引物 517R（5′-ATTACCGCGG CTGCTGG-3'）進(jìn)行16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物做變性梯度凝膠電泳。

1.3.6.3 變性梯度凝膠電泳（DGGE）

配制PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）凝膠濃度為8%（w/v），變性梯度為40%～60%(100%的變性劑包括42 g的尿素和40ml的甲酰胺)。在電泳槽中裝入7 L 1×TAE電泳緩沖液。取40%和60%變性溶液各15ml，分別加入 10%的過硫酸銨 160 μl、TEMED 13 μl，混勻，灌膠。小心插入梳子，讓凝膠聚合大約1 h，并把電泳控制裝置打開，預(yù)熱電泳緩沖液到60°C。取50μl體系PCR產(chǎn)物20μl,混入10μl上樣緩沖液，用注射進(jìn)樣器上樣，在預(yù)熱60℃的1×TAE（20mmol/l Tris-Cl、10 mmol/l醋酸、0.5 mmol/l Na2EDTA） 和 40 V 電壓下，電泳50min，然后在120 V電壓下，電泳4～5 h。PAGE膠在EB染液中染色25 min后用TANNON－2500凝膠成像系統(tǒng)采集圖象。

1.3.6.4 回收條帶PCR

DGGE凝膠中的主要條帶切下后用dd H2O沖洗，搗碎后用30μl TE buffer在4℃浸泡過夜。回收條帶的PCR產(chǎn)物再次經(jīng)DGGE檢測以確?；厥諚l帶PCR產(chǎn)物的正確。PCR產(chǎn)物用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（由Sangon Corp.生產(chǎn)）純化后連入PMD18-T載體，轉(zhuǎn)入E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，采用菌落PCR檢測陽性克隆，每個樣品隨機(jī)挑選3個載有插入片段的陽性克隆送樣測序。

1.3.7 發(fā)酵樣品指標(biāo)的測定

小肽含量測定：將待測樣品過80目篩，等體積加入10%三氯乙酸（TCA），在160 r/min搖床中培養(yǎng)30min，然后4000 r/min離心15 min，取上清液做適當(dāng)稀釋后用Folin-酚法[18]測定蛋白質(zhì)總量。

粗蛋白含量的測定：采用凱氏定氮法[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌的篩選

2.1.1 產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌的初篩

根據(jù)菌株產(chǎn)蛋白酶的能力采用透明圈法進(jìn)行初篩，菌落透明圈及比值λ（D/d）分別見圖1及表1。

圖1 菌落透明圈

由圖1和表1可知，除4株菌不產(chǎn)生透明圈外，其余8株芽孢桿菌都能在篩選培養(yǎng)基上形成明顯的水解透明圈。其中菌株BSW-2形成的透明圈直徑與菌落直徑的比值最大，說明其分解蛋白質(zhì)的能力最強(qiáng)。選擇比值λ≥3.00的菌株進(jìn)行復(fù)篩，分別為BS1、BS2、BSW-2、BSIF。

表1 透明圈直徑與菌落直徑之比

2.1.2 產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌的復(fù)篩

將初篩得到的4株芽孢桿菌進(jìn)行豆粕固體發(fā)酵試驗(yàn)，各菌株發(fā)酵樣品小肽含量見表2。

表2 各菌株發(fā)酵樣品小肽含量

由表2可知，菌株BSW-2發(fā)酵樣品中小肽含量最高，達(dá)到108.10mg/g，優(yōu)于其它菌株。結(jié)合初篩透明圈結(jié)果，說明菌株BSW-2降解豆粕蛋白質(zhì)能力最強(qiáng)，因此選擇BSW-2作為豆粕發(fā)酵的菌株。

2.2 枯草芽孢桿菌BSW-2發(fā)酵豆粕的單因素試驗(yàn)

2.2.1 接種量對小肽含量的影響(見圖2）

由圖2結(jié)果表明：當(dāng)接種量為0.5%時，豆粕發(fā)酵后小肽含量最高，為191.04mg/g。隨著接種量的增大，小肽含量有所下降。

圖2 不同接種量對小肽含量的影響

2.2.2 料水比對小肽含量的影響(見圖3）

圖3 不同料水比對小肽含量的影響

固態(tài)發(fā)酵通過料水比來控制物料的水分，水分含量影響發(fā)酵過程中微生物的生長。由圖3的結(jié)果可知，小肽的含量隨著料水比的增加，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)料水比為1：1.2時，小肽含量最高，為197.76mg/g。當(dāng)料水比過大時，小肽含量呈現(xiàn)減少的趨勢，可能是由于物料含水過多導(dǎo)致通氣性降低，從而影響此類好氧菌的生長，從而影響了蛋白質(zhì)降解成小肽。

2.2.3 發(fā)酵溫度對小肽含量的影響(見圖4）

圖4 不同溫度對小肽含量的影響

溫度是影響發(fā)酵效果的重要因素，溫度過高或過低都不利于菌體生長，因此一個合適的溫度至關(guān)重要。由圖4的結(jié)果可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時，小肽含量最高，為161.23mg/g。隨著溫度的升高，小肽含量呈現(xiàn)下降的趨勢，在溫度為50℃，小肽含量最低。

2.2.4 發(fā)酵時間對小肽含量的影響(見圖5）

圖5 不同發(fā)酵時間對小肽含量的影響

由圖5的結(jié)果可知：隨著發(fā)酵時間的延長，小肽的含量呈先上升后略有下降的趨勢。當(dāng)發(fā)酵時間為36 h時，小肽含量最高為177.29mg/g。隨著酶解時間的延長，小肽被進(jìn)一步酶解生成游離氨基酸，含量反而出現(xiàn)下降趨勢。

2.3 枯草芽孢桿菌BSW-2發(fā)酵豆粕條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，得到各因素的適宜水平后，設(shè)計4因素3水平L9（34）的正交試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，試驗(yàn)因素水平設(shè)計、試驗(yàn)設(shè)計及實(shí)施方案和結(jié)果見表3、表4。

表3 試驗(yàn)因素設(shè)計

表4 試驗(yàn)設(shè)計及實(shí)施方案與結(jié)果

2.3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果的直觀分析

從表4直觀分析可以看出，極差列中接種量因素的極差值最大，即接種量因素對小肽含量的影響最大，其次是發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、料水比。由均值分析得到各因素的趨勢見圖6。

圖6 各因素趨勢

由圖6可知，理論最優(yōu)條件為A1B2C2D2，即接種量0.5%，料水比1： 1.2，溫度35℃，時間36 h。

2.3.2 優(yōu)化條件的驗(yàn)證

從正交表中觀察得知最優(yōu)組合為2號A1B2C2D2，與理論最優(yōu)條件A1B2C2D2相同。因此對此方案進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測得小肽含量與粗蛋白含量，見表5。

表5 正交試驗(yàn)驗(yàn)證

由表5可知，驗(yàn)正后的結(jié)果為：當(dāng)接種量0.5%、料水比1：1.2、溫度35℃、時間36 h，發(fā)酵結(jié)束后小肽含量從11.52 mg/g提高到202.20 mg/g，粗蛋白從47.65%提高到55.63%。

2.4 PCR-DGGE方法分析發(fā)酵豆粕過程中細(xì)菌群落變化

提取發(fā)酵樣品細(xì)菌基因組總DNA，之后進(jìn)行16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用于變性梯度凝膠電泳，結(jié)果見圖7。

對圖7中標(biāo)記的條帶A、B、C進(jìn)行切膠回收，連接轉(zhuǎn)化后測序結(jié)果一致，且與芽孢桿菌BSW-216S rDNA相符，此結(jié)果證明了圖7與CK條帶處與同一位置的條帶都代表芽孢桿菌BSW-2。

由圖7可以看出，每個樣品中最亮的條帶在同一位置上，且與BSW-2在同一水平線上，可以說明從0 h開始芽孢桿菌BSW-2在整個發(fā)酵體系中都處于優(yōu)勢地位。對比每個樣品的條帶個數(shù)可知，從0 h到48 h呈明顯的遞減趨勢。隨著發(fā)酵時間的延長，0 h中其它的幾個條帶慢慢消失，可以說明BSW-2的生長會抑制其它細(xì)菌的生長，到發(fā)酵后期整個發(fā)酵體系中，BSW-2占有絕對的優(yōu)勢。

圖7 各樣品細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)特征片段DGGE指紋圖譜

3 討論

PCR-DGGE技術(shù)是近年來新興的一項開展微生物分子生態(tài)學(xué)研究的工具。本研究采用了此技術(shù)分析發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的變化，DGGE圖譜條帶的多少反映了分析樣品細(xì)菌種類的多樣性，條帶的亮度反映了其所代表的細(xì)菌在樣品中的生態(tài)位，亮度越高的條帶反映出該條帶代表的細(xì)菌在所分析樣品中占據(jù)優(yōu)勢的程度越高。PCR-DGGE技術(shù)也存在一些缺陷，例如，在總DNA提取過程中，待測細(xì)胞是否充分裂解，一些抑制DNA降解的物質(zhì)是否完全去除；在PCR擴(kuò)增過程中，如何使所有模板以均等幾率被擴(kuò)增；DGGE圖譜中的一個條帶是否就代表某一微生物等等。本試驗(yàn)將DGGE圖譜中的條帶進(jìn)行回收、轉(zhuǎn)化、測序來驗(yàn)證特征條帶，因此試驗(yàn)結(jié)果較為可靠。PCR-DGGE技術(shù)分析固體發(fā)酵過程中微生物群落變化，有助于更加深入了解整個發(fā)酵過程，從而為可能的固體發(fā)酵過程控制提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究篩選得到了一株能有效降解豆粕大分子蛋白的枯草芽孢桿菌BSW-2，并對其發(fā)酵豆粕的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明最佳工藝條件為：接種量0.5%、料水比1：1.2、發(fā)酵溫度35℃、發(fā)酵時間36 h。在此條件下，豆粕發(fā)酵后小肽含量從11.52mg/g提高到202.20 mg/g，粗蛋白含量從47.65%提高到55.63%。PCR-DGGE結(jié)果顯示：BSW-2從發(fā)酵開始就在整個發(fā)酵體系中占優(yōu)勢，隨著發(fā)酵時間的延長，BSW-2的生長會抑制其它細(xì)菌的生長，到發(fā)酵后期整個發(fā)酵體系中，BSW-2占有絕對的優(yōu)勢。

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（編輯：劉 占，laramie_liu@yahoo.com）

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1001-991X（2011）16-0059-05

2011-07-10

浙江省重大科技專項[2006C120971]；杭州市重大科技專項創(chuàng)新專項資助項目[20092112A41]