稻草與多水平苜?；旌狭鑫阁w外發(fā)酵組合效應(yīng)的整體研究

張吉鹍 鄒慶華 王金芬 熊立根

稻草與多水平苜?；旌狭鑫阁w外發(fā)酵組合效應(yīng)的整體研究

張吉鹍 鄒慶華 王金芬 熊立根

就稻草（RS）與苜蓿（MSL）混合瘤胃體外發(fā)酵組合效應(yīng)進(jìn)行整體評定。采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，體外批次培養(yǎng)48 h，應(yīng)用經(jīng)改進(jìn)的組合效應(yīng)多項(xiàng)指標(biāo)綜合指數(shù)（IMFAEI）對RS分別添補(bǔ)0、20%、40%、60%、80%與 100%MSL（MSL0、MSL20、MSL40、MSL60、MSL80與 MSL100）在 12、24與48 h研究瘤胃體外發(fā)酵的組合效應(yīng)。各組各時(shí)間點(diǎn)的 pH 值 6.75～6.88，NH3-N 3.11～28.74mg/100ml，微生物氮 2.91～14.57mg/ml，48 h各組累計(jì)產(chǎn)氣量與總揮發(fā)性脂肪酸分別為120.1～162.4 ml/g OM與41.51～55.45 mmol/l。各組的IMFAEI自高到低的排序?yàn)椋篗SL60（1.2711）、MSL40（1.2603）、MSL20（0.8265）與 MSL80（0.6333）。本研究RS與MSL適宜添補(bǔ)量為40%～60%。

稻草；苜蓿；體外發(fā)酵；組合效應(yīng)；整體

稻草（RS）是我國南方的主要農(nóng)作物秸稈，由于其自身營養(yǎng)素的缺乏及硅、木質(zhì)素等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量較高，不僅使得飼喂單一RS的反芻動(dòng)物過瘤胃蛋白與生葡萄糖物質(zhì)水平低，而且使得RS在瘤胃內(nèi)不能很好地被微生物發(fā)酵而導(dǎo)致消化率降低，從而不能有效地利用日糧的能量[1]。提供纖維分解菌的生長所需的氮源，優(yōu)化秸稈在瘤胃的發(fā)酵，是提高反芻動(dòng)物生長的重要措施?？墒?，常規(guī)蛋白資源如餅粕類短缺價(jià)高，限制了其在像我國這樣的發(fā)展中國家的普及使用。此外，現(xiàn)流行的日補(bǔ)喂兩次精料，對于飼喂低質(zhì)秸稈基礎(chǔ)日糧的反芻動(dòng)物，只能短暫升高瘤胃的氨、硫化物等營養(yǎng)素的濃度，也就是說全天僅有部分時(shí)間能氮較平衡，有利于瘤胃微生物特別是纖維分解菌的生長進(jìn)而促進(jìn)纖維的消化[2]。因此，很有必要探討其它氮源補(bǔ)充料，來改善我國反芻動(dòng)物的營養(yǎng)狀況。Dixon[3]報(bào)道，豆科牧草在瘤胃降解緩慢釋放出氮、硫及其它營養(yǎng)物質(zhì)，可為瘤胃微生物提供能被纖維分解菌同步利用的可降解氮與可發(fā)酵能。對低質(zhì)秸稈基礎(chǔ)日糧補(bǔ)飼豆科牧草必能促進(jìn)纖維分解菌的生長，從而提高秸稈的消化率[4]。苜蓿（Medicago sativa L.，MSL）不僅是反芻動(dòng)物的蛋白質(zhì)補(bǔ)充飼料，而且還是反芻動(dòng)物的主要能量飼料[2]。因此，選擇MSL進(jìn)行補(bǔ)飼，已引起越來越多學(xué)者的關(guān)注[5-6]。利用飼料間的組合效應(yīng)來改善進(jìn)入反芻動(dòng)物體內(nèi)的營養(yǎng)平衡，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，是提高稻草等秸稈飼料利用率的重要舉措[7-8]。然而迄今，體外法研究反芻動(dòng)物秸稈基礎(chǔ)飼料補(bǔ)飼苜蓿多見于體外發(fā)酵特征的影響[9-10]或幾個(gè)發(fā)酵參數(shù)組合效應(yīng)的綜合評定[11-12]，而將體外發(fā)酵特征與發(fā)酵參數(shù)組合效應(yīng)綜合評定結(jié)合起來進(jìn)行整體研究的報(bào)道鮮見。故本研究擬通過體外批次培養(yǎng)，探討RS添補(bǔ)不同水平MSL的瘤胃體外發(fā)酵特征，并應(yīng)用經(jīng)改進(jìn)的組合效應(yīng)多項(xiàng)指標(biāo)綜合指數(shù)（MFAEI）對體外發(fā)酵參數(shù)組合效應(yīng)進(jìn)行綜合評定以探討出RS的MSL適宜添補(bǔ)量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

RS為收獲稻谷后的晚稻草，MSL為整株植株。粉碎過40目篩，備作常規(guī)化學(xué)成分分析與體外產(chǎn)氣試驗(yàn)。

1.2 化學(xué)成分分析

試驗(yàn)所用 RS、MSL中干物質(zhì)（DM）、粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）與粗灰分（Ash）的測定依據(jù) AOAC[13]的方法進(jìn)行，而中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）與酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）則采用Van Soest等[14]的方法進(jìn)行測定。體外發(fā)酵所用RS與MSL的常規(guī)營養(yǎng)成分見表1。MSL的粗蛋白含量高，纖維含量低，是較為理想的稻草補(bǔ)充飼料。

表1 試驗(yàn)用粗飼料的常規(guī)營養(yǎng)成分(g/kg DM)

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用單因子6處理重復(fù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，RS與 MSL 分別以 100： 0(MSL0)、80： 20(MSL20)、60： 40(MSL40)、40： 60(MSL60)、20： 80(MSL80) 與 0： 100(MSL100)的比例組成6個(gè)組合進(jìn)行體外發(fā)酵，共進(jìn)行2個(gè)批次。在進(jìn)行批次發(fā)酵時(shí)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)1個(gè)空白對照組與1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)干草組，用于校正各時(shí)間點(diǎn)因取樣、培養(yǎng)瓶的體積差異、大氣壓變化以及瘤胃液菌源變異所引起的產(chǎn)氣量變化。

1.4 瘤胃液供體動(dòng)物

選 3只體況良好、體重相近（33±1）kg、安裝有永久性瘤胃瘺管的山羊供采集瘤胃液用。日糧的精粗比為3：7，以混合粗飼料（RS與MSL各半）700 g/d為基礎(chǔ)飼料，另按干物質(zhì)計(jì)日補(bǔ)充300 g精料。日喂兩次（08：00 和 18：00）、自由飲水、常規(guī)光照。

1.5 體外培養(yǎng)裝置及發(fā)酵液的配制

采用由Theodorou等[15]建立并經(jīng)Mauricio等[16]改進(jìn)的壓力傳感器體外產(chǎn)氣技術(shù)進(jìn)行體外批次培養(yǎng)，壓力傳感技術(shù)主體裝置由若干產(chǎn)氣瓶、產(chǎn)氣瓶支架、壓力傳感器、帶特定軟件的計(jì)算機(jī)及恒溫培養(yǎng)箱等組成。每批可同時(shí)培養(yǎng)60個(gè)樣品。本試驗(yàn)所用發(fā)酵液的配制按照Mauricio等[16]介紹的配制。

1.6 體外批次培養(yǎng)液的取樣與有關(guān)指標(biāo)分析

本試驗(yàn)所測定的反映體外批次培養(yǎng)發(fā)酵性能的指標(biāo)為體外批次培養(yǎng)液中的pH值、氨氮（NH3-N）濃度、產(chǎn)氣量（GP）、揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）與微生物氮（MN）。在12、24和48 h記錄產(chǎn)氣量時(shí)迅速取樣測定有關(guān)指標(biāo)。

1.6.1 pH值

用SartoriusPB-20型pH值計(jì)直接測定。

1.6.2 NH3-N濃度

參照馮宗慈等[17]的比色方法進(jìn)行測定。

1.6.3 GP

每個(gè)批次培養(yǎng)48 h，分別記錄在培養(yǎng)后的12、24與48 h的壓力，每次讀數(shù)后即將瓶內(nèi)的氣體放掉。

1.6.4 VFAs

用島津GC-2010型氣相色譜儀測定。

1.6.5 MN

其中，RNA含氮量為17.83%，細(xì)菌氮中RNA含氮量為10%。

1.6.6 稻草添補(bǔ)苜蓿單個(gè)時(shí)間點(diǎn)特定指標(biāo)組合效應(yīng)的計(jì)算

單個(gè)時(shí)間點(diǎn)特定指標(biāo)（如產(chǎn)氣量）的組合效應(yīng)計(jì)算公式[20]如下：

式中，實(shí)測值為實(shí)際測定的樣品特定指標(biāo)值[如產(chǎn)氣量（m l）]，加權(quán)估算值＝苜蓿的實(shí)測值×苜蓿配比(%)＋秸稈基礎(chǔ)料的實(shí)測值×秸稈基礎(chǔ)料的配比(%)。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH值（見表2）

瘤胃液pH值是衡量瘤胃發(fā)酵狀況的敏感指標(biāo)，瘤胃pH值影響微生物合成效率。Henning等[21]研究表明，體外培養(yǎng)一般在6 h后開始出現(xiàn)累積現(xiàn)象，pH值下降。培養(yǎng)液pH值高低能反映底物被發(fā)酵利用的程度，pH值越低，說明發(fā)酵產(chǎn)酸累積越多，而發(fā)酵終產(chǎn)物累積會(huì)影響細(xì)菌的生長[22]。由表2可見，所測定時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)液pH值為6.75～6.88。RS與不同比例MSL組合體外發(fā)酵的pH值，除MSL60的pH值較高外，其次為MSL40，而以MSL80最低，且各組pH值均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而降低。但是，所測定的pH值均在瘤胃微生物特別是纖維分解菌生長所需的pH值范圍（6.2～7.0）內(nèi)[23]。瘤胃發(fā)酵加強(qiáng)時(shí)，VFAs等（如乳酸等其它有機(jī)酸）增加引起pH值下降，同時(shí)由于飼料蛋白質(zhì)分解加速使得氨的濃度增加，導(dǎo)致pH值上升。瘤胃的最終pH值是飼料中碳水化合物與含氮物質(zhì)在瘤胃發(fā)酵產(chǎn)物綜合作用的結(jié)果。體外批次發(fā)酵的pH值還與所用緩沖液的緩沖能力有關(guān)，發(fā)酵基質(zhì)中添補(bǔ)的豆科牧草（如本研究中所用的苜蓿）中所含的豐富礦物質(zhì)會(huì)加強(qiáng)這種緩沖能力。本研究表明RPT體外培養(yǎng)體系所采用的緩沖液緩沖能力較強(qiáng)，足以維持培養(yǎng)液的pH值在正常范圍之內(nèi)，段智勇[24]在用此系統(tǒng)研究稻草NDF添加不同水平的玉米淀粉組合效應(yīng)時(shí)，測得的稻草NDF和玉米淀粉混合物培養(yǎng)液24 h pH值在6.68～6.84范圍，并沒有隨玉米淀粉含量的增加與培養(yǎng)時(shí)間的延長而顯著降低。Sommart等[25]在用瓶子產(chǎn)氣系統(tǒng)研究稻草或5%尿素處理稻草添補(bǔ)不同水平的木薯對體外微生物發(fā)酵特性與微生物蛋白合成的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)盡管pH值受到木薯的添加水平及粗飼料的影響，且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而顯著降低，但pH值在6.70～6.88范圍。本研究的pH值與這些研究結(jié)果相似。

表2 稻草與不同比例苜蓿組合體外培養(yǎng)48 h pH值的變化

2.2 NH3-N濃度（見表3）

表3 稻草與不同比例苜蓿組合體外培養(yǎng)12～48 h NH3-N的變化（mg/100ml）

瘤胃內(nèi)NH3-N既是瘤胃氮代謝過程中外源（飼料）蛋白質(zhì)、內(nèi)源含氮物質(zhì)降解的重要產(chǎn)物，同時(shí)也是在有能量和碳鏈的情況下，瘤胃微生物合成菌體蛋白的原料。Clark等[26]通過體外批次發(fā)酵研究證明，在瘤胃微生物區(qū)系中，約80%的瘤胃細(xì)菌以NH3作為生長的唯一氮源，約50%的細(xì)菌既可以NH3-N，也可以氨基酸作為生長的氮源，另26%的細(xì)菌其生長離不開NH3-N。因此，瘤胃內(nèi)NH3-N濃度是瘤胃內(nèi)環(huán)境參數(shù)的重要指標(biāo)，是瘤胃內(nèi)飼料蛋白降解及微生物對NH3-N利用的綜合反映。體外批次發(fā)酵體系中的NH3-N濃度，主要取決于：首先，發(fā)酵基質(zhì)中的蛋白質(zhì)含量及其降解率與理化特性；其次，含氮物質(zhì)與能量載體物質(zhì)的比例，能氮釋放是否同步；再次為微生物蛋白的合成效率與微生物自溶。這三個(gè)因素關(guān)系緊密、相互影響，存在著一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系。NH3-N濃度過低會(huì)影響微生物蛋白產(chǎn)量，過高表明氨釋放速度高于其利用與吸收速度，造成氨的損失。Owens等[27]指出，瘤胃內(nèi)微生物蛋白合成所需的NH3-N濃度為0.35～29mg/100ml。本研究的NH3-N濃度位于3.11～28.74mg/100ml。NH3-N濃度隨MSL比例的提高而增加（P＜0.05），隨發(fā)酵時(shí)間的增加而降低，所測定的時(shí)間點(diǎn)均以MSL的比例達(dá)100%時(shí)的NH3-N濃度最高，這與苜蓿蛋白的降解率較高有關(guān)[28]，但所測定值均在有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的范圍之內(nèi)。一些學(xué)者就適于微生物生長的最佳NH3-N濃度作了較為深入的探討，Schaefer等[29]報(bào)道，體外培養(yǎng)液中滿足微生物生長需要的理想NH3-N濃度為 2～5mg/100ml。Petersen[30]報(bào)道，放牧反芻動(dòng)物瘤胃液中NH3-N濃度在1～2mg/100ml時(shí)，就可滿足細(xì)菌對纖維降解的需要。Hoover[31]則認(rèn)為，瘤胃微生物生長適宜氨氮濃度為3.3～8.0 mg/100ml，由于日糧蛋白質(zhì)及碳水化合物（CHO）發(fā)酵的差異，實(shí)際上瘤胃液中氨氮的變化幅度多在1～76 mg/100ml，從而影響瘤胃微生物活性。Clark等[26]證實(shí)奶牛瘤胃液中的NH3-N濃度在2 mg/100ml時(shí)，就能滿足瘤胃微生物合成蛋白的需要。可見瘤胃微生物以氨作氮源合成瘤胃微生物氮的效率相當(dāng)高，即使瘤胃液中的NH3-N濃度很低，亦能為微生物利用[29]。因此，可以認(rèn)為本研究中的NH3-N濃度足以滿足瘤胃微生物生長的需要，有效能成為合成微生物蛋白的主要制約因素。而通過添補(bǔ)MSL來提高瘤胃微生物消化RS中難以消化的纖維的能力是組合效應(yīng)發(fā)生的基礎(chǔ)。

2.3 產(chǎn)氣量及其組合效應(yīng)

2.3.1 產(chǎn)氣量

RS與不同比例MSL混合培養(yǎng)在所選定時(shí)間點(diǎn)的累計(jì)產(chǎn)氣量見表4。各組的產(chǎn)氣量均隨MSL在混合物中比例的增加而增加，與其他學(xué)者報(bào)道的相似[32,33]，組間差異隨培養(yǎng)時(shí)間的延長降低，到24 h時(shí)MSL60、MSL80與MSL100的產(chǎn)氣量差異不顯著（P＞0.05），并保持至48 h。此外，在48 h MSL20與MSL40的差異亦不顯著（P＞0.05）。產(chǎn)氣量隨MSL在混合發(fā)酵基質(zhì)中比例的增加而非線性地增加，說明在產(chǎn)氣量上存在著組合效應(yīng)。

表4 稻草與不同比例苜?；旌吓囵B(yǎng)在所選定時(shí)間點(diǎn)的累計(jì)產(chǎn)氣量(ml/1 gOM)

2.3.2 產(chǎn)氣量的組合效應(yīng)(見表5)

表5 稻草與不同比例苜蓿組合在產(chǎn)氣量（GP）上的組合效應(yīng)

表5反映的是RS與MSL混合培養(yǎng)時(shí)的產(chǎn)氣量及其單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)氣量的加權(quán)值之差的百分比（本研究中定義為RS與MSL混合培養(yǎng)時(shí)在產(chǎn)氣量上的組合效應(yīng)值），即各混合發(fā)酵基質(zhì)在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)累計(jì)產(chǎn)氣量的組合效應(yīng)值，表5同時(shí)還標(biāo)明了應(yīng)用t檢驗(yàn)比較分析各組合的觀察值與預(yù)測值顯著水平。從表5可以看出，除MSL80在培養(yǎng)到12 h組合效應(yīng)達(dá)到峰值外 (P＜0.05)，其余 3 組（MSL20、MSL40、MSL60）均在24 h達(dá)到峰值(P＜0.05或 P＜0.01)，而以 MSL60組亦即當(dāng)苜蓿添加比例占發(fā)酵基質(zhì)總量的60%時(shí)，組合效應(yīng)最大為10.51%(P＜0.01)。各組的組合效應(yīng)在達(dá)到峰值后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長緩慢下降。12 h MSL80的組合效應(yīng)最大，其次是MSL40。MSL80在12 h后急劇下降至 24 h的 1.84%（P＞0.05），MSL40 與 MSL20 在 12 h后上升至24 h的峰值(P＜0.05)。24 h以MSL60最大，其次是MSL40與MSL20，48 h的組合效應(yīng)只有MSL 60 達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，其余差異不顯著（P＞0.05），最差的是MSL80。Liu等[20]的研究證明，稻草或碳酸氫銨（NH4HCO3）處理的稻草與禾本科干草或桑葉混合培養(yǎng)時(shí)，自12至96 h幾乎所有水平（25%、50%、75%與100%）的組合效應(yīng)均為正值，且組合效應(yīng)值總的趨勢是隨培養(yǎng)時(shí)間延長而降低，但同樣并非所有時(shí)間點(diǎn)的組合效應(yīng)均達(dá)到顯著水平。本研究結(jié)果與這些結(jié)果相似。同樣有人在未經(jīng)處理的秸稈中添補(bǔ)棉粕以及在尿素處理的秸稈中添補(bǔ)花生粕觀察到了正組合效應(yīng)，但未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）?？墒牵琒ampath[34]等用體外產(chǎn)氣法（自12、52至166 h）研究未經(jīng)處理的粟秸添補(bǔ)不同比例的花生粕觀察到正組合效應(yīng)，且達(dá)顯著水平（P＜0.05）。與本研究中的苜蓿相似，花生粕、棉粕與桑葉均含有較多的快速可發(fā)酵碳水化合物與蛋白質(zhì)。Cone等[35]與Groot[36]的研究證明初期產(chǎn)氣主要是基質(zhì)中水溶組分如糖與蛋白質(zhì)等的發(fā)酵所貢獻(xiàn)。因此，可以認(rèn)為稻草基礎(chǔ)日糧添補(bǔ)苜蓿的組合效應(yīng)可能是由于苜蓿為纖維分解菌提供了可發(fā)酵的能量與蛋白質(zhì)（氨基酸或肽），加速纖維分解菌的增殖引起。就單一的產(chǎn)氣指標(biāo)評定組合效應(yīng)而言，稻草基礎(chǔ)日糧中添補(bǔ)苜蓿的比例以占整個(gè)日糧總量的60%為宜。

2.4 揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量及其組合效應(yīng)

2.4.1 揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量

RS添補(bǔ)不同比例的MSL，對體外培養(yǎng)12～48 h乙酸、丙酸與丁酸及總VFAs產(chǎn)量，以及乙酸與丙酸比的影響見表6～表10，從這些表可以看出，乙酸、丙酸與丁酸及總VFAs產(chǎn)量自12～48 h，均隨時(shí)間延長而增加，且各時(shí)間點(diǎn)均隨MSL比例的增加而增加，與Sommart[37]及王旭[32]等的結(jié)論相似，顯著水平見相應(yīng)表。表明基質(zhì)中MSL水平影響VFAs的生成，本研究中48 h總VFAs位于41.51 mmol/l到55.45 mmol/l的范圍，與瘤胃液中的濃度相似[25]，表明沒有發(fā)生體外批次培養(yǎng)常見的酸累積現(xiàn)象，從而保證微生物的正常生長。體外培養(yǎng)時(shí)所產(chǎn)生的氣體與揮發(fā)性脂肪酸有很大的關(guān)系，產(chǎn)氣量高的揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量亦高，不同MSL水平組總VFAs產(chǎn)量隨培養(yǎng)時(shí)間延長的變化規(guī)律與前述產(chǎn)氣量的變化結(jié)果相一致。丙酸是反芻動(dòng)物主要的生糖前體物質(zhì)，易發(fā)酵碳水化合物有利于形成丙酸發(fā)酵型[38]，本研究中丙酸產(chǎn)量隨MSL在混合發(fā)酵基質(zhì)中比例的增加而增加，有關(guān)顯著水平見表7，可能與苜蓿細(xì)胞內(nèi)容物中所含的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物有關(guān)。反芻動(dòng)物揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)量與其能量代謝密切相關(guān)，總VFAs的提高表明底物的消化率上升，而若總VFAs中丙酸的比例上升，則表明消化后能量的利用率較高，再結(jié)合考察表10中的乙酸/丙酸摩爾比值（多數(shù)組間差異不顯著）可知，MSL40、MSL60、MSL80與MSL100四個(gè)混合組的能量利用率均隨總VFAs的提高而略有提高，這與段智勇[24]在研究稻草NDF與玉米淀粉的組合效應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)經(jīng)體外培養(yǎng)發(fā)酵后，基質(zhì)的消化率和能量的消化率均上升，但能量的利用率并沒有提高的研究結(jié)果相反，可能與所用的發(fā)酵基質(zhì)不同有關(guān)，段智勇[24]所用的稻草NDF為純營養(yǎng)素，而玉米則為營養(yǎng)素載體的飼料形式，本研究中的RS與MSL均為營養(yǎng)素載體的不同飼料形式，MSL除含有可降解蛋白、苜?？傑胀?，還含有水溶性物質(zhì)等。

表6 稻草與不同比例苜蓿組合體外培養(yǎng)12～48 h乙酸產(chǎn)量的變化（mmol/l）

表7 稻草與不同比例苜蓿組合體外培養(yǎng)12～48 h丙酸產(chǎn)量的變化（mmol/l）

表8 稻草與不同比例苜蓿組合體外培養(yǎng)12～48 h丁酸的變化（mmol/l）

表9 稻草與不同比例苜蓿組合體外培養(yǎng)12～48 h總揮發(fā)性脂肪酸的變化（mmol/l）

表10 稻草與不同比例苜蓿組合體外培養(yǎng)12～48 h乙酸/丙酸摩爾比的變化

至于乙酸/丙酸比，RS與不同比例MSL組合體外培養(yǎng)12～48 h乙酸/丙酸摩爾比在所測定的時(shí)間點(diǎn)均隨MSL比例的增加而減少，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加，顯著水平見表10。乙酸/丙酸比值在Sommart等[25]與段智勇[24]報(bào)道的范圍內(nèi)（2.11～2.56），較王旭[32]報(bào)道的要高，但純稻草的乙酸/丙酸比值較Sommart等[25]報(bào)道的2.56與段智勇[24]報(bào)道的純稻草NDF的2.53要低，造成這些差異的原因可能與發(fā)酵的基質(zhì)、基質(zhì)內(nèi)不同組分的互作有關(guān)。Sinclair等[39]研究表明，根據(jù)碳水化合物和蛋白質(zhì)在瘤胃的降解特性，通過日糧組分間的互補(bǔ)組合而使碳水化合物與蛋白質(zhì)發(fā)酵同步，不僅可以改變瘤胃發(fā)酵類型，同時(shí)有利于維持瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。并指出能氮同步性高的日糧瘤胃揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）穩(wěn)定，且同步性效應(yīng)對丙酸產(chǎn)量影響總趨勢是同步性高，丙酸產(chǎn)量高，間接說明隨著MSL的提高，基質(zhì)的同步性提高。從表10還可以說明，RS添補(bǔ)不同比例的MSL沒有改變瘤胃微生物的發(fā)酵類型，表明總體而言，總揮發(fā)性脂肪酸（VFAS）、乙酸與丙酸的摩爾比不受MSL所含瘤胃可降解蛋白的影響。但從表7可看出丙酸產(chǎn)量趨向隨MSL水平的提高而提高，丙酸產(chǎn)量提高的速度要高于乙酸，乙酸與丙酸的摩爾比隨MSL水平的提高而降低是由于丙酸產(chǎn)量提高所至。由于丙酸是反芻動(dòng)物利用效率較高的一種揮發(fā)性脂肪酸，說明在適當(dāng)?shù)谋壤秶鷥?nèi)（本研究中為40%～100%），尤其是在 60%～100%，“RS-MSL”組合的能量利用效率有提高的趨勢，且這種能量利用效率似乎主要與MSL的添加比例成正比，這與段智勇[24]報(bào)道的能量的利用效率不存在正的組合效應(yīng)甚至負(fù)的組合效應(yīng)相一致。

2.4.2 總揮發(fā)性脂肪酸的組合效應(yīng)(見表11)

表11 稻草與不同比例苜蓿組合體外培養(yǎng)12～48 h總揮發(fā)性脂肪酸的組合效應(yīng)

從表11可以看出，稻草與不同比例苜蓿組合體外培養(yǎng)12～48 h總VFAs的組合效應(yīng)，除MSL40外，其余3組在不同時(shí)間點(diǎn)多為負(fù)值，即組合效應(yīng)為負(fù)值。除在12 h，MSL40與MSL60組合效應(yīng)顯著（P＜0.01）外，其余差異均不顯著（P＞0.05）。所測定時(shí)間點(diǎn)“RS-MSL”的組合效應(yīng)變化不具規(guī)律性，在12 h與48 h MSL40的組合效應(yīng)最大，而在24 h MSL60組合效應(yīng)最大，表明對于多時(shí)間點(diǎn)的體外培養(yǎng)，用單項(xiàng)指標(biāo)很難準(zhǔn)確評定RS添補(bǔ)MSL的組合效應(yīng)。

2.4.3 乙酸/丙酸摩爾比的組合效應(yīng)(見表12)

表12 稻草與不同比例苜蓿組合體外培養(yǎng)12～48 h乙酸/丙酸摩爾比的組合效應(yīng)

從表12可知，稻草與不同比例苜蓿組合體外培養(yǎng)12～48 h乙酸/丙酸摩爾比的組合效應(yīng)較小，甚至出現(xiàn)負(fù)值。負(fù)值表明乙酸/丙酸值降低，在能量利用率上表現(xiàn)了略正的組合效應(yīng)?？傮w而言，稻草基礎(chǔ)日糧添補(bǔ)不同比例的苜蓿后，在總VFAs與乙酸/丙酸摩爾比上不像產(chǎn)氣那樣表現(xiàn)出明顯的組合效應(yīng)。段智勇[24]在研究不同飼料（稻草、羊草與苜蓿）來源的NDF與不同來源的淀粉（玉米淀粉與小麥淀粉）的組合效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)組合在產(chǎn)氣量上發(fā)生正組合效應(yīng)的同時(shí)，總揮發(fā)性脂肪酸濃度發(fā)生了正效應(yīng)，乙丙酸比例也為正效應(yīng)，表明脂肪酸濃度上升了，乙丙酸比例亦隨之上升，即在發(fā)生組合效應(yīng)時(shí)，能量的消化率上升，而其利用率則下降，本研究結(jié)果除乙酸/丙酸摩爾比的組合效應(yīng)與段智勇[24]略有差異外，其余與段智勇[24]報(bào)道的基本相似。

2.5 微生物氮產(chǎn)量及其組合效應(yīng)

2.5.1 微生物氮產(chǎn)量(見表13)

表13 稻草與不同比例苜蓿組合體外培養(yǎng)12～48 h微生物氮的變化（mg/100ml）

從表13可以看出，微生物氮（MN）隨發(fā)酵基質(zhì)中MSL比例的提高而增加，24 h前隨發(fā)酵時(shí)間的延長而增加，在24 h達(dá)到最大值，隨后下降，有關(guān)顯著水平詳見表13。培養(yǎng)初期可能由于底物中苜蓿細(xì)胞內(nèi)容物中的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物，能為瘤胃微生物提供可消化的能量及苜蓿瘤胃降解蛋白所提供的營養(yǎng)素如氨（NH3）、肽與含硫氨基酸以及支鏈脂肪酸等，故可啟動(dòng)細(xì)菌生長，刺激纖維分解菌增殖，細(xì)菌總?cè)郝溲杆僭鲋?，直到底物中可利用能和可利用氮受到限制時(shí)，菌體蛋白合成開始下降。各處理組MN迅速增殖期均出現(xiàn)在培養(yǎng)24 h前，在24 h達(dá)到峰值，此后逐漸下降。Sommart等[37]亦發(fā)現(xiàn)體外微生物的合成效率在24 h后下降，這種下降與36 h后的NH3-N濃度下降同步。微生物的合成效率在24 h后下降可能與發(fā)酵基質(zhì)減少有關(guān)，或與瘤胃微生物發(fā)生溶菌有關(guān)。本研究48 h的NH3-N濃度比24 h低，看來主要與發(fā)酵基質(zhì)減少有關(guān)。

體外產(chǎn)氣間接反映了用于發(fā)酵的底物中碳水化合物組分的降解，與揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的產(chǎn)量呈正相關(guān)，但與微生物產(chǎn)量不一定呈正相關(guān)，甚至是負(fù)相關(guān)。Blümmer等[40]的研究證明，產(chǎn)氣量或VFA與微生物產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)。本研究中的產(chǎn)氣量、總VFA與MN除產(chǎn)氣量的個(gè)別組外均隨苜蓿在混合發(fā)酵基質(zhì)中的比例升高而升高，也就是說這三者之間未出現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

2.5.2 微生物氮產(chǎn)量的組合效應(yīng)

稻草基礎(chǔ)日糧添補(bǔ)不同比例苜蓿在微生物氮（MN）上的組合效應(yīng)見表14，均為正組合效應(yīng)。根據(jù)系統(tǒng)整體營養(yǎng)調(diào)控理論[41]原理，與單個(gè)粗飼料相比，由于多個(gè)粗飼料組成的混合發(fā)酵底物具有正組合效應(yīng)，優(yōu)化了微生物整體利用可發(fā)酵底物的能力[26]，同時(shí)更接近供體瘤胃內(nèi)底物組成，理論上菌體蛋白產(chǎn)量應(yīng)該最大。Lee等[42]以稻草與精料配置了兩種能氮釋放同步和極不同步的日糧，體外培養(yǎng)結(jié)果表明同步性高的日糧微生物氮產(chǎn)量高。從本試驗(yàn)結(jié)果看，各時(shí)間點(diǎn)均以MSL60的組合效應(yīng)最大，其次為MSL40的，說明稻草中添補(bǔ)60%或40%的苜蓿后營養(yǎng)素（能、氮）更加平衡，能氮釋放同步性高于其它組，更能提高動(dòng)物生產(chǎn)性能[43]。從而證實(shí)在以低質(zhì)秸稈為基礎(chǔ)的日糧中，適當(dāng)補(bǔ)充蛋白質(zhì)飼料（或氨基酸）、可發(fā)酵氮源，可以實(shí)現(xiàn)能氮的同步釋放，激發(fā)飼料間正組合效應(yīng)，充分發(fā)揮飼料的生產(chǎn)率。王旭[32]的研究亦證實(shí)了這一點(diǎn)，她在將玉米秸、谷草分別與沙打旺等量混合后，再將此混合粗飼料與精料按7：3混合，發(fā)現(xiàn)其微生物氮產(chǎn)生量遠(yuǎn)高于混合前各單個(gè)粗飼料以及各單個(gè)粗飼料與精料混合的產(chǎn)生量(P＜0.05)。

在瘤胃內(nèi)，日糧含氮物質(zhì)和能量載體物質(zhì)經(jīng)瘤胃微生物的同化作用，以可利用養(yǎng)分的形式在微生物和動(dòng)物機(jī)體之間協(xié)調(diào)分配。微生物對蛋白質(zhì)和碳水化合物的利用具有明顯的互作效應(yīng)[44,45]，瘤胃微生物氮的產(chǎn)量在很大程度上依賴于瘤胃內(nèi)可利用能與可利用氮的利用率。瘤胃微生物生長受許多因素制約，其中當(dāng)能量和養(yǎng)分之間的供給不匹配，尤其是當(dāng)微生物對可利用能和可利用氮的利用不同步時(shí)，會(huì)限制微生物的生長。如果蛋白質(zhì)不足或利用不充分，則會(huì)降低碳水化合物（CHO）的利用率；反之，如果CHO和蛋白質(zhì)的利用不匹配，則會(huì)造成氮素（主要以氨的形式）損失。

表14 稻草與不同比例苜蓿組合體外培養(yǎng)12～48 h微生物氮的組合效應(yīng)

2.6 稻草與添補(bǔ)不同比例苜蓿體外發(fā)酵組合效應(yīng)的綜合評定

碳水化合物在瘤胃發(fā)酵釋放的碳原子，主要被用于合成氣體（CO2與CH4）、VFAs與微生物。其中VFAs與微生物經(jīng)代謝為宿主（反芻動(dòng)物）提供能量（占機(jī)體總能的70%～80%）與蛋白質(zhì)，而氣體則呼出體外。故在進(jìn)行稻草與不同比例苜蓿體外發(fā)酵參數(shù)組合效應(yīng)的綜合評定時(shí)，主要選擇產(chǎn)氣量、總VFAs與微生物氮3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評定。

盧德勛[46]針對體外培養(yǎng)中多時(shí)間點(diǎn)、多指標(biāo)組合效應(yīng)的計(jì)算，提出了組合效應(yīng)綜合指數(shù)（MFAEI），對飼料間的組合效應(yīng)進(jìn)行了整體量化，由此可對飼料間組合效應(yīng)的大小進(jìn)行了直觀而明確的比較。筆者集成現(xiàn)有組合效應(yīng)的評定技術(shù)，改進(jìn)了盧德勛[46]的MFAEI，經(jīng)改進(jìn)的組合效應(yīng)綜合評定指數(shù)（IMFAEI）的計(jì)算見下列公式。IMFAEI繼承了盧德勛[46]MFAEI的整體觀、動(dòng)態(tài)觀，不同點(diǎn)在于引入了現(xiàn)流行的單個(gè)時(shí)間點(diǎn)、單個(gè)指標(biāo)組合效應(yīng)的計(jì)算方法[20]。本研究在計(jì)算時(shí)IMFAEI只考慮產(chǎn)氣量、總VFAs與微生物氮（MN）3個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)對組合效應(yīng)的整體貢獻(xiàn)。

單項(xiàng)組合效應(yīng)值（SFAEI）的計(jì)算為：

注：A1系單一基礎(chǔ)飼料秸稈（此為稻草，下同）各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)（此為12 h、24 h與48 h，下同）各單一指標(biāo)（此為GP,總 VFAs及MN）的組合效應(yīng)值；A2為單一添補(bǔ)飼料（此為苜蓿）各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)各單一指標(biāo)的組合效應(yīng)值；A3為A1與A2以不同比例構(gòu)成的混合物各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)各單一指標(biāo)的組合效應(yīng)值；C為基礎(chǔ)飼料秸稈在混合飼料中的比例，（1-C）為添補(bǔ)飼料在混合飼料中的比例，A4為每個(gè)時(shí)間點(diǎn)A3總和。n為測定各單一指標(biāo)組合效應(yīng)值時(shí)間點(diǎn)的個(gè)數(shù)（此為3）。

多項(xiàng)組合效應(yīng)值（MFAEI）的計(jì)算是將GP、總VFAs與MN的單項(xiàng)組合效應(yīng)值（SFAEI）相加。

表15 稻草與不同比例苜蓿組合體外培養(yǎng)12-48 h組合效應(yīng)的綜合評定

從表15可以看出，稻草添補(bǔ)不同比例苜蓿的組合效應(yīng)經(jīng) IMFAEI綜合評定的結(jié)果為：MSL60＞MSL40＞MSL20＞MSL80，與 GP、總 VFAs與 MN 評定結(jié)果的排序并不一致。本研究的結(jié)果表明，稻草基礎(chǔ)日糧以添補(bǔ)40%～60%的苜蓿效果較好，能夠?qū)崿F(xiàn)組合效應(yīng)的最大化。同時(shí)從表15還可以看出，稻草基礎(chǔ)日糧中即使添補(bǔ)20%的苜蓿亦能取得較好的效果，添加80%的苜蓿組合效應(yīng)值則顯著降低。正如盧德勛[41]所指出的，任何問題都有一個(gè)“度”，而不是越多越好，適量才會(huì)出現(xiàn)正面效應(yīng)，反之，出現(xiàn)負(fù)面效應(yīng)。參木有[47]的研究證明反芻動(dòng)物日糧中適宜的飼草替換秸稈的比例為30%～60%，本研究稻草基礎(chǔ)日糧添補(bǔ)苜蓿的適宜比例在此范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

本研究表明：稻草基礎(chǔ)日糧以添補(bǔ)40%～60%的苜蓿效果較好。

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（編輯：劉敏躍，lm-y@tom.com）

Com prehensive study of associative effects of rice straw m ixed w ith vary levels of M edicago sativa L.on in vitro fermentation parameters

Zhang Jikun,Zou Qinghua,Wang Jinfen,Xiong Ligen

To overall evaluation research the associative effects of rice straw(RS)supplemented with Medicago sativa L.(MSL)on in vitro fermentation parameters.48 h in vitro batch incubation was practiced in a single-factor randomized design to investigate the associative effects of RSmixed with varying MSL levels of 0,20%,40%,60%,80%and 100%(MSL0,MSL20,MSL40,MSL60,MSL80 and MSL100)on in vitro fermentation traits at 12,24 and 48 h individually,and the improved multiple-factors associative effects index (IMFAEI)was used.The range of parameters of various groups at different time was：pH 6.75～6.88,NH3-N 3.11～28.74 mg/100ml,MN 2.91～14.57 mg/ml.48 h cumulative gas production and total volatile fatty acids were 120.1～162.4ml/g OM and 41.51-55.45mmol/l individually.The IMFAEI ranked from greatest to least in the following order：MSL60(1.2711),MSL40(1.2603),MSL20(0.8265),and MSL80(0.6333).40%～60%MSL is the optimal volume supplemented to ruminant RS basal diet.

rice straw；medicago sativa L.；in vitro fermentation；associative effects；comprehensiveevaluation

S816.32

A

1001-991X（2011）17-0040-09

張吉鹍，江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，博士，研究員，330200，江西南昌蓮塘南蓮路602號。

鄒慶華、熊立根，單位及通訊地址同第一作者。

王金芬，山東省濱州職業(yè)學(xué)院。

2011-04-25

反芻動(dòng)物飼料安全評價(jià)項(xiàng)目、國家自然科學(xué)基金[31060313]與江西自然科學(xué)基金[2008GZN0007]資助