小鼠竇前卵泡二維體外培養(yǎng)法的優(yōu)化研究

王喜艷，潘曉燕，孫艷美，吳迪，史沛德，王富

吉林醫(yī)藥學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，吉林省吉林市 132013

卵泡的生長發(fā)育依次經(jīng)歷原始卵泡、初級卵泡(primary follicles，PM卵泡)、次級卵泡、竇卵泡及成熟卵泡等階段[1]，整個卵泡的發(fā)育過程受來自垂體的卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)和黃體生成素(luteinizing hormone，LH)的調(diào)控[2-3]。卵泡的發(fā)育過程分為FSH依賴階段及非FSH依賴階段[4]。竇卵泡時期是FSH依賴階段，F(xiàn)SH對竇卵泡的生長發(fā)育及類固醇激素合成是必需的[5]。但FSH對竇前卵泡生長發(fā)育的作用尚不清楚。Pedersen等[6]和Mandl等[7]將小鼠的竇前卵泡分為原始卵泡、初級卵泡和次級卵泡。Halpin等[8]發(fā)現(xiàn)，在FSH缺乏的情況下，直徑為150～180 μm的竇前卵泡在體外無法生長，其生長發(fā)育要依賴于FSH。Cortvrindt等[9]的研究也發(fā)現(xiàn)FSH能促進(jìn)小鼠95～142 μm的竇前卵泡存活，表明PM卵泡及早期次級卵泡(early second follicles，ES卵泡)均已獲得了對FSH的敏感性，但其接受FSH刺激的能力尚不清楚。目前常選擇直徑為80～180 μm的竇前卵泡進(jìn)行體外培養(yǎng)，但培養(yǎng)效果不穩(wěn)定，導(dǎo)致了卵泡不同的體外發(fā)育率[10-12]?？紤]該直徑的卵泡差異較大，包括了PM卵泡和ES卵泡階段，很可能這兩個階段的卵泡對FSH刺激具有不同的敏感性，因而在FSH刺激下使得卵泡具有不同的體外發(fā)育率。因此，進(jìn)一步研究各級竇前卵泡對FSH的敏感性，確定最佳的FSH添加濃度和選擇最佳發(fā)育階段的竇前卵泡進(jìn)行培養(yǎng)，將會進(jìn)一步促進(jìn)竇前卵泡的體外發(fā)育。

本研究將直徑80～100 μm的PM卵泡和直徑110～130 μm的ES卵泡置于不同F(xiàn)SH濃度培養(yǎng)液中培養(yǎng)，觀察FSH對卵泡體外生長情況、空間生長模式及分泌功能的影響，以確定小鼠竇前卵泡培養(yǎng)的最佳時期和FSH的最佳添加濃度，優(yōu)化小鼠竇前卵泡的二維培養(yǎng)體系，提高小鼠竇前卵泡的體外發(fā)育率。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 出生第14天的雌性清潔級ICR小鼠40只，購自吉林大學(xué)實驗動物中心。小鼠飼養(yǎng)在可控的環(huán)境中，室溫(22±2) ℃，濕度(50±10)%，維持14 h:10 h的光照:黑暗周期，自由飲食。本實驗經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會審核批準(zhǔn)，實驗過程符合動物實驗研究管理規(guī)定。

1.2 竇前卵泡體外培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死小鼠，迅速取其雙側(cè)卵巢置于含10%胎牛血清(FBS)的L-15工作液(美國Gibco公司，11415064)中。在體視鏡下，分離去除卵巢周圍的組織，機(jī)械分離出卵泡。根據(jù)Pedersen等[6]的卵泡分級標(biāo)準(zhǔn)，選取直徑80～100 μm、含有1～2層顆粒細(xì)胞的PM卵泡和直徑110～130 μm、含有3層顆粒細(xì)胞的ES卵泡，分別置于含有10 mU/ml或100 mU/ml重組FSH(r-FSH)、5% FBS、1%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(insulin-transferrinselenium，ITS)的α-MEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)10 d。隔天半定量換液，同時觀察記錄各組卵泡生長情況。第10天置入含有2.5 U/ml人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)的α-MEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)16 h。用拉長的細(xì)玻璃吸管去除卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocytes complexes，COCs)周圍的顆粒細(xì)胞，觀察第一極體的排出情況，具有第一極體的卵母細(xì)胞為成熟卵母細(xì)胞。

1.3 ELISA法檢測培養(yǎng)液中雌二醇(estradiol，E2)水平 于第4、8、10天的下午3點收集卵泡培養(yǎng)液，-20 ℃保存。每組每次培養(yǎng)40個卵泡，收集各組的卵泡培養(yǎng)液4次，采用ELISA試劑盒(中國博奧森，bsk00483)檢測培養(yǎng)液中的E2水平。

1.4 Western blotting檢測卵泡中FSH受體(FSHR)、類固醇激素合成限速酶3β-羥基類固醇脫氫酶(3b-HSD)、17α-羥化酶(CYP17)及芳香化酶(CYP19)的表達(dá)水平 獲取培養(yǎng)第8天和第10天的卵泡各80個，利用RIPA強(qiáng)裂解液(含1% PMSF)提取蛋白。制膠，上樣，120 V恒壓電泳約80 min，然后300 mA濕轉(zhuǎn)膜60 min，再用5%脫脂奶粉封閉1 h，最后以兔源FSH受體抗體、3b-HSD抗體、CYP17抗體、CYP19抗體或GAPDH抗體孵育，4 ℃過夜。以GAPDH作為內(nèi)參。次日以辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(以上抗體均購自中國博奧森公司)室溫孵育1 h。最后，將轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜放入Tanon 4600成像系統(tǒng)，覆上增強(qiáng)顯影液200 μl，用Tanon Imaging System軟件進(jìn)行攝片。每個實驗組重復(fù)3次后用Tanon GIS ID軟件分析圖片的灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以表示，卵泡的貼壁面積分析及卵泡中FSHR表達(dá)水平比較采用t檢驗，其他數(shù)據(jù)的比較采用方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FSH對竇前卵泡體外生長發(fā)育的影響 體外分離出的PM卵泡及ES卵泡見圖1。大部分卵泡于第2天開始貼壁生長；第4天各組卵泡的顆粒細(xì)胞增殖突破基膜，ES卵泡更為明顯；第6天ES卵泡顆粒細(xì)胞繼續(xù)增殖向周圍膨出，而PM卵泡的顆粒細(xì)胞未向周圍膨出；第8天大部分ES卵泡開始出現(xiàn)卵泡腔，而僅有極少數(shù)培養(yǎng)在100 mU/ml r-FSH中的PM卵泡出現(xiàn)卵泡腔；第10天卵泡腔繼續(xù)增大，竇卵泡接近成熟(圖2)。

圖1 體外分離出的初級卵泡(A)和早期次級卵泡(B)(倒置顯微鏡，標(biāo)尺=100 μm)Fig.1 The in vitro isolated PM follicles (A) and ES follicles(B) (Inverted microscope, bar=100 μm)

圖2 初級卵泡和次級卵泡體外生長情況(倒置顯微鏡，標(biāo)尺=100 μm)Fig.2 The in vitro development of PM follicles and ES follicles (Inverted microscope, bar=100 μm)

PM卵泡在100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中的存活率高于在10 mU/ml r-FSH中的存活率，ES卵泡在10、100 mU/ml r-FSH中的存活率均高于PM卵泡在10、100 mU/ml r-FSH中的存活率，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；ES卵泡在10 mU/ml r-FSH與在100 mU/ml r-FSH中的存活率無明顯差異。PM卵泡培養(yǎng)在10 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中不能形成竇卵泡，而在100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中36.14%的PM卵泡形成竇卵泡。ES卵泡在10、100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中均可形成竇卵泡，且在100 mU/ml r-FSH中的成腔率明顯高于在10 mU/ml r-FSH中的成腔率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 PM、ES卵泡在不同F(xiàn)SH濃度下的體外發(fā)育及成熟情況比較(±s，n=8)Tab.1 Development and maturity of PM and ES follicles in vitro (±s, n=8)

表1 PM、ES卵泡在不同F(xiàn)SH濃度下的體外發(fā)育及成熟情況比較(±s，n=8)Tab.1 Development and maturity of PM and ES follicles in vitro (±s, n=8)

與PM卵泡10 mU/ml FSH組比較，(1)P<0.05；與PM卵泡100 mU/ml FSH組比較，(2)P<0.05；與ES卵泡10 mU/ml FSH組比較，(3)P<0.05。

組別 FSH濃度(mU/ml) 存活率(%) 成腔率(%) 成熟率(%)PM卵泡 10 93.23±1.98 0.00±0.00 0.00±0.00 100 99.50±1.12(1) 36.14±4.02(1) 23.54±7.62(1)ES卵泡 10 98.35±1.6(1) 78.63±4.13(1) 48.55±3.73(1)100 99.60±0.90 92.74±2.54(2)(3) 80.88±4.02(2)(3)F 21.015 895.444 272.486 P<0.001 <0.001 <0.001

2.2 FSH對竇前卵泡發(fā)育成熟的影響 卵泡發(fā)育成熟后，排出具有第一極體的成熟M2期卵母細(xì)胞(圖3)。PM卵泡培養(yǎng)在含10 mU/ml r-FSH的培養(yǎng)液中，由于未形成竇卵泡，故無成熟的卵母細(xì)胞；在含100 mU/ml r-FSH的培養(yǎng)液中，PM卵泡的成熟率明顯低于ES卵泡，表明ES卵泡期為竇前卵泡體外培養(yǎng)的最佳時期。ES卵泡在含100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中的卵母細(xì)胞成熟率明顯高于在10 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中的成熟率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

圖3 排出的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(A)及成熟的卵母細(xì)胞(B)(倒置顯微鏡，標(biāo)尺=50 μm)Fig.3 The expelled COCs (A) and matured oocytes (B)(Inverted microscope, bar=50 μm)

2.3 FSH對卵泡體外空間生長方式的影響 大部分PM卵泡在體外生長到第6天后不再繼續(xù)生長。ES卵泡在10、100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中呈現(xiàn)兩種不同的生長方式：在10 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中生長的ES卵泡，在培養(yǎng)皿底部呈平鋪式生長；而在100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中生長的ES卵泡顏色較暗，呈立體三維空間生長方式，更接近于體內(nèi)卵泡的生長模式(圖4)。ES卵泡在10 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中形成的竇卵泡貼壁面積為(35 861±325) μm2，明顯大于在100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中形成的竇卵泡的貼壁面積[(23 083±291) μm2]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.83，P<0.05)。在100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中生長的ES卵泡更能模擬體內(nèi)卵泡的生長。

2.4 FSH對卵泡分泌E2水平的影響 ES卵泡組卵泡在第4、8、10天的E2水平明顯高于PM卵泡組；PM卵泡在10、100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中的E2分泌水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；ES卵泡在100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中的E2分泌水平明顯高于10 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液(表2)。

2.5 竇前卵泡中FSHR的表達(dá) FSHR在PM卵泡和ES卵泡中均有表達(dá)，ES卵泡中FSHR的相對表達(dá)水平(1.86±0.32)明顯高于PM卵泡(1.19±0.28)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.94，P<0.05，圖5)。

2.6 FSH對卵泡中類固醇激素合成限速酶3b-HSD、CYP17及CYP19表達(dá)的影響 培養(yǎng)第8天和第10天，在10、100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中PM卵泡3b-HSD、CYP17及CYP19的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而在100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中的ES卵泡較10 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中的ES卵泡CYP17及CYP19表達(dá)明顯升高，且在100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中生長的ES卵泡3b-HSD、CYP19表達(dá)水平較PM卵泡明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖6，表3)。

3 討 論

目前，小鼠竇前卵泡最常用的體外培養(yǎng)方法是二維液滴法[13-15]。研究者們多采用80～180 μm的竇前卵泡進(jìn)行體外培養(yǎng)[10-12]，培養(yǎng)液中常用的FSH濃度為10或100 mU/ml[11-12,16]，在上述條件一致的情況下，卵泡卵母細(xì)胞的體外成熟率為60%～70%[13-15]，體外成熟效果不穩(wěn)定，成熟率差異很大(8.00%～80.88%)[14,16-17]。Cortvrindt等[9]選取95～142 μm的卵泡在100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中進(jìn)行二維培養(yǎng)，獲得了41%的M2期卵母細(xì)胞。本研究選取ES卵泡培養(yǎng)在100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中，獲得了80.88%的卵母細(xì)胞成熟率。導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟率差異很大的原因可能是80～180 μm的竇前卵泡包括了PM、ES這兩個階段的卵泡，這些卵泡的大小和顆粒細(xì)胞多少存在差異，對FSH刺激具有不同的敏感性，使在相同濃度FSH的作用下，PM卵泡及ES卵泡具有不同的發(fā)育率及成熟率，最終導(dǎo)致小鼠竇前卵泡體外培養(yǎng)的效果不穩(wěn)定。因此，本研究在培養(yǎng)前對竇前卵泡進(jìn)行嚴(yán)格選擇，選擇ES卵泡進(jìn)行體外培養(yǎng)，獲得了高效、穩(wěn)定的小鼠竇前卵泡。

圖4 竇卵泡的生長模式(倒置顯微鏡，標(biāo)尺=100 μm)Fig.4 The growth model of antral follicles (Inverted microscope, bar=100 μm)

表2 培養(yǎng)液中的E2含量(ng/L, ±s, n=4)Tab.2 The concentration of E2 in culture media (ng/L, ±s, n=4)

表2 培養(yǎng)液中的E2含量(ng/L, ±s, n=4)Tab.2 The concentration of E2 in culture media (ng/L, ±s, n=4)

與PM卵泡10 mU/ml FSH組比較，(1)P<0.05；與PM卵泡100 mU/ml FSH組比較，(2)P<0.05；與ES卵泡10 mU/ml FSH組比較，(3)P<0.05。

組別 FSH濃度(mU/ml) 第0天 第4天 第8天 第10天PM卵泡 10 0.00±0.00 1.18±0.40 2.45±0.44 3.30±0.34 100 0.00±0.00 2.35±0.59 3.84±1.03 4.62±0.61 ES卵泡 10 0.00±0.00 4.21±0.69(1) 5.29±0.47(1) 8.62±0.62(1)100 0.00±0.00 6.49±1.81(2)(3) 9.97±1.86(2)(3) 14.08±1.75(2)(3)F 14.396 19.095 70.773 P 0.001 0.001 <0.001

圖5 竇前卵泡中FSH受體的表達(dá)Fig.5 The expression of FSH receptor in preantral follicles

圖6 培養(yǎng)第8、10天卵泡中3b-HSD、CYP17及CYP19的表達(dá)水平Fig.6 Expressions of 3b-HSD, CYP17 and CYP19 in follicles at day 8 and day 10

表3 培養(yǎng)第8、10天卵泡中3b-HSD、CYP17及CYP19表達(dá)水平比較 (±s, n=4)Tab.3 Expressions of the rate-limiting enzymes for steroid hormone synthesis at day 8 and day 10 (±s, n=4)

表3 培養(yǎng)第8、10天卵泡中3b-HSD、CYP17及CYP19表達(dá)水平比較 (±s, n=4)Tab.3 Expressions of the rate-limiting enzymes for steroid hormone synthesis at day 8 and day 10 (±s, n=4)

與PM卵泡10 mU/ml FSH組比較，(1)P<0.05；與PM卵泡100 mU/ml FSH組比較，(2)P<0.05；與ES卵泡10 mU/ml FSH組比較，(3)P<0.05。

組別 r-FSH濃度(mU/ml) 第8天 第10天3b-HSD CYP17 CYP19 3b-HSD CYP17 CYP19 PM卵泡 10 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 100 0.00±0.00 0.00±0.00 1.18±0.35 0.00±0.00 0.03±0.00 0.02±0.00 ES 卵泡 10 0.24±0.08(1) 0.24±0.07(1) 1.18±0.35(1) 0.12±0.04(1) 0.22±0.06(1) 0.38±0.09(1)100 0.26±0.01(2) 0.51±0.03(2)(3) 2.23±0.41(2)(3) 0.27±0.07(2)(3) 0.43±0.08(2)(3) 1.29±0.11(2)(3)F 8.247 10.039 23.271 11.875 14.575 18.463 P 0.001 0.001 <0.001 0.001 0.001 0.001

Hardy等[18]發(fā)現(xiàn)，直徑<110 μm的卵泡在含有10 ng/ml r-FSH以及不含F(xiàn)SH的環(huán)境中生長速度無明顯差異。Kumar等[19]將FSH基因敲除，發(fā)現(xiàn)早期卵泡的生長仍能維持，卵泡可以很好地發(fā)育到次級卵泡階段；Dierich等[20]發(fā)現(xiàn)，在FSH受體缺失的情況下，雌性小鼠不能排卵，但卵泡能發(fā)育到成腔之前。以上研究表明，小鼠初級卵泡生長可能不依賴于FSH。本研究也發(fā)現(xiàn)，在PM卵泡的體外培養(yǎng)過程中添加不同濃度的FSH，大部分PM卵泡培養(yǎng)至第6天生長就會減緩，且不能形成卵泡腔。因此，在竇前卵泡體外培養(yǎng)過程中，如果將PM卵泡也進(jìn)行培養(yǎng)，會明顯降低卵泡的發(fā)育率及成熟率。因此，目前的小鼠竇前卵泡二維培養(yǎng)體系不適合PM卵泡的體外培養(yǎng)，其合適的培養(yǎng)體系仍需進(jìn)一步研究。

卵泡對FSH刺激的應(yīng)答反應(yīng)與FSH受體的表達(dá)密切相關(guān)[12]。Otkay等[21]發(fā)現(xiàn)，在含有1層顆粒細(xì)胞的初級卵泡上已有FSH受體的表達(dá)，本研究也發(fā)現(xiàn)在PM卵泡、ES卵泡上均有FSH受體的表達(dá)，但ES卵泡的FSH受體表達(dá)水平明顯高于PM卵泡，ES卵泡對FSH的刺激較為敏感，100 mU/ml r-FSH更能刺激ES卵泡的發(fā)育。且在100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中ES卵泡CYP17及CYP19的表達(dá)明顯高于10 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中培養(yǎng)時。CYP17及CYP19在卵泡顆粒細(xì)胞中可將膜細(xì)胞合成的雄烯二酮轉(zhuǎn)變?yōu)镋2，因此，在100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中ES卵泡E2的表達(dá)明顯高于在10 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中培養(yǎng)時。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH不僅會影響竇前卵泡的體外發(fā)育率，還會影響竇前卵泡的體外發(fā)育模式。ES卵泡在10 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中呈平鋪式生長模式，缺乏立體感，貼壁的底面積較大；而在100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中則呈立體的空間生長模式，貼壁的底面積較小，與體內(nèi)卵泡的生長模式非常接近。雖有研究報道了FSH會影響竇前卵泡的發(fā)育[22-24]，但未見FSH影響竇前卵泡體外生長模式的報道。原因可能是大部分研究均將PM卵泡及ES卵泡一起培養(yǎng)，在發(fā)育率不高的情況下未發(fā)現(xiàn)發(fā)育模式的差異。本研究將次級卵泡與初級卵泡分開培養(yǎng)，從而發(fā)現(xiàn)了FSH對卵泡體外生長模式的影響。因此，將ES卵泡培養(yǎng)在100 mU/ml r-FSH培養(yǎng)液中，不僅提高了卵泡的分泌功能及體外發(fā)育率，且使卵泡的體外生長模式更接近于體內(nèi)。

綜上所述，目前常用的小鼠竇前卵泡二維培養(yǎng)體系不適合PM卵泡的培養(yǎng)，其合適的培養(yǎng)系統(tǒng)仍需進(jìn)一步研究。ES卵泡(110～130 μm)在100 mU/ml r-FSH的二維培養(yǎng)環(huán)境中可獲得較高的體外發(fā)育率及成熟率，100 mU/ml r-FSH能明顯刺激ES卵泡顆粒細(xì)胞快速增殖，使其向立體空間生長，并促使更多的類固醇激素合成限速酶表達(dá)，合成、分泌更多的雌激素，最終獲得較高的卵母細(xì)胞成熟率。因此，將ES卵泡培養(yǎng)在100 mU/ml r-FSH的二維液滴中，是一個理想的、能模擬體內(nèi)卵泡生長模式的小鼠竇前卵泡二維培養(yǎng)體系。