聚乙二醇修飾對(duì)牛乳β-乳球蛋白抗原性的影響

蔡小飛，鐘俊楨，劉成梅*，劉 偉，徐雨佳，羅舜菁

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

聚乙二醇修飾對(duì)牛乳β-乳球蛋白抗原性的影響

蔡小飛，鐘俊楨，劉成梅*，劉 偉，徐雨佳，羅舜菁

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

通過(guò)不同修飾反應(yīng)物質(zhì)的量比、修飾反應(yīng)時(shí)間、pH值，用單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯(SC-mPEG)對(duì)牛乳β-乳球蛋白(β-LG)進(jìn)行修飾，研究其抗原性的變化。利用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)結(jié)合產(chǎn)物的抗原性，結(jié)果顯示不同條件下PEG修飾后的β-乳球蛋白的抗原性最高降低率，反應(yīng)8h時(shí)為70.2%。三硝基苯磺酸(TNBS)法測(cè)定不同條件反應(yīng)后樣品修飾度，反應(yīng)8h時(shí)最高修飾度為39.1%。結(jié)果表明修飾反應(yīng)時(shí)間為SC-mPEG修飾β-LG后其抗原性降低的主要因素。

β-乳球蛋白；聚乙二醇；ELISA；抗原性

β-乳球蛋白(β-LG)是乳清蛋白中的主要蛋白質(zhì)，約占乳清蛋白總量的43.6%～50%，分子質(zhì)量約為18kD[1]。β-LG含有人體多種必需氨基酸，具有結(jié)合視黃醇及部分脂肪酸等功能[2]，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。然而，它又是牛乳中最主要的過(guò)敏源之一，82%的牛乳過(guò)敏患者對(duì)牛乳β-LG產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)[3]。目前用于消除β-LG抗原性的方法有熱處理[4]、酶水解[5]、高壓結(jié)合熱處理[6]、糖基化[7]等。

近年來(lái)采用聚乙二醇(PEG)修飾蛋白質(zhì)改性已被廣泛使用。胰蛋白酶[8]、脂肪酶[9-10]以及過(guò)氧化物酶[11]經(jīng)PEG修飾后熱穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)；Zhang等[12]報(bào)道胰蛋白酶經(jīng)硝基苯甲酸酯活化的聚乙二醇修飾后更加穩(wěn)定；Kazan等[13]報(bào)道大腸桿菌青霉素?；附?jīng)PEG修飾后其活性增強(qiáng)20倍。Abuchowski等[14]研究PEG修飾牛血清白蛋白發(fā)現(xiàn)，其消除或降低抗原性效果明顯。目前已獲美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)上市的PEG修飾的多種蛋白質(zhì)類(lèi)藥物被用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，用來(lái)降低蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的免疫原性、降低毒副作用、延長(zhǎng)血漿半衰期等[15]。此外，PEG本身免疫原性極弱，通常在PEG修飾物免疫的動(dòng)物血清中檢測(cè)不到特異性的抗PEG抗體[16]，因而避免引入新的過(guò)敏源。

本研究以PEG修飾β-LG，應(yīng)用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定其抗原性的變化，為開(kāi)發(fā)有效的、切實(shí)可行的降低β-LG抗原性方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

日本大白兔，8周齡，雄性，體質(zhì)量約為3kg，飼養(yǎng)于江西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)站。

牛乳β-乳球蛋白、豬源的明膠、羊抗兔酶標(biāo)二抗、三硝基苯磺酸(TNBS) 美國(guó)Sigma公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯(SC-mPEG，純度95%，20kD) 北京四環(huán)科技開(kāi)發(fā)有限公司；酶標(biāo)板 美國(guó)Corning公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan MK3酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；AR224CN電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；DELTA 320 pH計(jì) 瑞士Mettler公司；DU640紫外分光光度計(jì)美國(guó)Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 多抗的制備與效價(jià)檢測(cè)

1.3.1.1 抗體的制備

選取2只日本大白兔，分別編號(hào)為1和2，所選白兔喂養(yǎng)的食物中確保不含牛乳蛋白。喂養(yǎng)一周無(wú)異常后，采血制備陰性血清。然后開(kāi)始免疫，用牛乳β-乳球蛋白純品免疫。免疫動(dòng)物所用的佐劑為弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，采用的免疫途徑為皮下多點(diǎn)注射方式，抗原免疫所需劑量為每只兔子1mg/mL，每?jī)芍苊庖咭淮?，共免?次[17]。

每隔二周實(shí)時(shí)檢測(cè)抗體效價(jià)。動(dòng)脈取血后，將采集的血清先傾斜置于室溫放置0.5h，讓其凝血，然后4℃冰箱放置過(guò)夜。翌日，4000r/min離心3min，分離血清，分裝后，ˉ2 0℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)

根據(jù)李欣等[18]的方法，具體操作步驟如下：1)包被：采用96孔酶標(biāo)板，每孔加入的2.5μg/mL包被抗原100μL，4℃過(guò)夜。2)洗滌：恢復(fù)至室溫，傾去包被液，每孔加PBST 300μL洗滌3次，每次5min，扣干。3)封阻：每孔加250μL 1%的明膠作為封阻液，37℃保溫保濕1h，恢復(fù)至室溫，傾去封阻液，PBST滿孔洗滌3次，每次5min，扣干。4)加待測(cè)血清：每孔加入100μL用PBS倍比稀釋的抗血清和陰性血清，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照(加PBS)，37℃保溫保濕1h后，用PBST洗滌3次，扣干。5)加酶標(biāo)二抗：每孔加入100μL 1:50 00稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG酶標(biāo)二抗，37℃保溫保濕1h后，以PBST洗滌3次，扣干。6)顯色：每孔加入反應(yīng)底物100μL，37℃保溫避光反應(yīng)15min。7)終止反應(yīng)：每孔加入50μL 2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)。8)比色：450nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以P/N＞2，且P＞0.2時(shí)抗血清的最大稀釋倍數(shù)為抗血清效價(jià)，其中P為陽(yáng)性血清的OD450nm，N為陰性血清的OD450nm。

1.3.2 SC-mPEG修飾β-LG[19]

1.3.2.1 反應(yīng)溶液的pH值對(duì)修飾產(chǎn)物的影響

4℃于β-LG溶液中按物質(zhì)的量比1: 4加入SC-mPEG，反應(yīng)pH值分別為6.0、7.0、7.5、8.0，反應(yīng)12h后，8%冰醋酸終止反應(yīng)，分別取樣測(cè)定抗原性與修飾度。

1.3.2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)修飾產(chǎn)物的影響

pH6.0、4℃于β-LG溶液中按物質(zhì)的量比1:4加入SC-mPEG，反應(yīng)時(shí)間分別為4、8、12、16、24h，8%冰醋酸終止反應(yīng)，分別取樣測(cè)定抗原性與修飾度。

1.3.2.3 物質(zhì)的量比對(duì)修飾產(chǎn)物的影響

β-LG和SC-mPEG的物質(zhì)的量比分別設(shè)為1: 2、1: 3、1:4、1:5、1:6，反應(yīng)溶液的pH6.0，反應(yīng)溫度為4℃。反應(yīng)12h后，用8%冰醋酸終止反應(yīng)，分別取樣測(cè)定抗原性與修飾度。

1.3.3 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定SC-mPEG修飾β-LG產(chǎn)物的抗原性

采用Kleber等[20]的方法，經(jīng)包被、洗滌、封阻、加多抗與競(jìng)爭(zhēng)抗原、加酶標(biāo)二抗、顯色、終止反應(yīng)、比色的步驟。其中加多抗與競(jìng)爭(zhēng)抗原為：競(jìng)爭(zhēng)抗原(即檢測(cè)樣：修飾后樣品與β-LG)50μL與50μL稀釋的抗血清加入包被有抗原的孔板內(nèi)反應(yīng)12h后，設(shè)置無(wú)競(jìng)爭(zhēng)對(duì)照孔(PBS代替競(jìng)爭(zhēng)抗原)。按照公式(1)計(jì)算抗原性降低率[21]。

式中：A為被測(cè)物用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處所測(cè)吸光度。

1.3.4 TNBS法測(cè)定修飾度

采用三硝基苯磺酸法[22]，取0.25mL樣品、2mL pH8.0磷酸緩沖溶液與2mL 0.1% TNBS溶液混合，在50℃暗室中反應(yīng)60min。反應(yīng)完畢后，用4mL 0.1mol/L HCl終止反應(yīng)。室溫下放置30min后，于340nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度。按照β-LG的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未修飾蛋白含量。按著公式(2)計(jì)算修飾度。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫反應(yīng)的效價(jià)變化

采用間接ELISA法測(cè)定免疫動(dòng)物抗體效價(jià)的變化。由圖1可知，多克隆抗體的制備方案可以得到高效價(jià)特異性抗體，當(dāng)免疫到第7周時(shí)抗體的效價(jià)都有明顯上升。由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自身的免疫能力差異，兔1的抗體效價(jià)要高于兔2的。兔1的效價(jià)最高，約達(dá)1:2×105以上，符合實(shí)驗(yàn)需要，本實(shí)驗(yàn)均采用兔1的抗體。

圖1 免疫過(guò)程中抗血清效價(jià)的變化Fig.1 Change in antiserum titer during immunization

2.2 修飾條件對(duì)修飾度的影響

TNBS法得到β-LG修飾度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=0.1151x+0.0127(R2=0.9931)，式中y為340nm波長(zhǎng)處所測(cè)吸光度，x為β-LG的濃度。將所測(cè)樣品的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算，得到未修飾蛋白含量，總蛋白含量為PEG修飾前β-LG含量，再按照公式(2)計(jì)算得到修飾度如圖2所示。

圖2 不同反應(yīng)條件對(duì)β-LG修飾度的影響Fig.2 Effects of different conditions on the modification degree of β-LG

修飾度是PEG修飾蛋白質(zhì)研究中的一項(xiàng)重要指標(biāo)。由圖2可知，在其他條件相同的情況下，pH值對(duì)修飾度的影響不大，其中pH7.0時(shí)修飾度為最大11.5%；時(shí)間對(duì)修飾度的影響非常明顯，8h達(dá)最大值38%；物質(zhì)的量比對(duì)修飾度的影響不大，β-LG與SC-mPEG物質(zhì)的量比1:3時(shí)，修飾度最大，達(dá)到13.7%。因此，在PEG修飾β-LG中，時(shí)間對(duì)修飾度的影響效果最為明顯。

2.3 反應(yīng)條件對(duì)對(duì)修飾產(chǎn)物抗原性的影響

2.3.1 反應(yīng)pH值對(duì)修飾產(chǎn)物抗原性的影響

圖3 反應(yīng)pH值對(duì)修飾產(chǎn)物抗原性的影響Fig.3 Effect of reaction pH on the antigenicity of PEG-modified products

由圖3可知，在其他條件相同的情況下，反應(yīng)pH值對(duì)修飾產(chǎn)物抗原性有一定的影響，但變化范圍不大，隨著反應(yīng)pH值的增加，修飾產(chǎn)物抗原性降低率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在pH7.0時(shí)抗原性降低率最高為20.6%，此時(shí)的修飾度最大為11.5%。

2.3.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)修飾產(chǎn)物抗原性的影響

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)修飾產(chǎn)物抗原性的影響Fig.4 Effect of reaction time on the antigenicity of PEG-modified products

由圖4可知，在其他條件相同的情況下，反應(yīng)時(shí)間對(duì)修飾產(chǎn)物抗原性影響非常明顯，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，修飾產(chǎn)物抗原性降低率呈現(xiàn)先增大后減小再增大的趨勢(shì)，在8h時(shí)抗原性降低率(68.3%)為最高，而此時(shí)的修飾度為38.0%，因而修飾度越高的條件下抗原性降低率也越高。PEG修飾過(guò)程中可能對(duì)賴氨酸等氨基酸的修飾將部分或全部地掩蓋表面抗原決定簇，從而降低免疫原性。

2.3.3 物質(zhì)的量比對(duì)修飾產(chǎn)物抗原性的影響

由圖5可知，在其他條件相同的情況下，修飾反應(yīng)物質(zhì)的量比對(duì)修飾產(chǎn)物的抗原性有一定的影響，隨著反應(yīng)中PEG的增加，修飾產(chǎn)物抗原性降低率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。在β-LG和SC-mPEG物質(zhì)的量比為1:3時(shí)抗原性降低率為最高24.7%，此時(shí)修飾度為最大13.7%，說(shuō)明物質(zhì)的量比為1:3時(shí)可能掩蓋β-LG表面抗原決定簇部分最多而導(dǎo)致抗原性降低率最高。隨著PEG的增加，β-LG抗原性降低率下降，可能是PEG增加蛋白的溶解性[23]，蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使得隱藏在分子內(nèi)部的抗原表位暴露出來(lái)，而交聯(lián)反應(yīng)的β-LG阻止了PEG與其進(jìn)行反應(yīng)，修飾度也隨著降低。

圖5 物質(zhì)的量比對(duì)修飾產(chǎn)物抗原性的影響Fig.5 Effect of molar ratio on the antigenicity of PEG-modified products

綜上，可以得出PEG修飾β-LG的最佳反應(yīng)條件為pH7.0、反應(yīng)時(shí)間8h、β-LG與SC-mPEG物質(zhì)的量比1:3。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以得到此時(shí)的抗原性降低率為70.2%，修飾度為39.1%。

3 結(jié) 論

PEG修飾β-LG反應(yīng)中，體系修飾中物質(zhì)的量比、反應(yīng)時(shí)間、pH值是影響修飾度和抗原性的重要因素，而時(shí)間對(duì)抗原性降低率的影響效果最大。最佳反應(yīng)條件即pH7.0、反應(yīng)時(shí)間8h、β-LG與SC-mPEG物質(zhì)的量比1:3時(shí)的抗原性降低率為70.2%，修飾度為39.1%。

[1]章玉濤. 牛奶中β-乳球蛋白的生物學(xué)活性及其影響因素[J]. 中國(guó)奶牛, 2010(2): 43-45.

[2]HATTORI M, NUMAMOTO K, KOBAYASHI K, et al. Functional changes in beta-lactoglobulin by conjugation with cationic saccharides [J]. J Agric Food Chem, 2000, 48(6): 2050-2056.

[3]AOKI T, ISKANDAR S, YOSHIDA T, et al. Reduced immunogenicity of beta-lactoglobulin by conjugating with chitosan[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2006, 70(10): 2349-2356.

[4]FOEGEDING E A, DAVIS J P, DOUCET D. Advances in modifying and understanding whey protein functionality[J]. Food Science & Technology, 2002, 13(5): 151-159.

[5]WROBLEWSKA B, KARAMACM, AMAROWICZ R, et al. Immunoreactive properties of peptide fractions of cow whey milk proteins after enzymatic hydrolysis[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2004, 39(8): 839-850.

[6]ZHONG Junzhen, LIU Chengmei, LIU Wei, et al. Effect of dynamic high-pressure microfluidization at different temperatures on the antigenic response of bovine β-lactoglobulin[J]. Eur Food Res Technol, 2011, doi: 10.1007/s00217-011-1500-2.

[7]HATTORI M, MIYAKAWA S, OHAMA Y. Reduced immunogenicity of beta-lactoglobulin by conjugation with acidic oligosaccharides[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(14): 4546-4553.

[8]GAERTNER H F, PUIGSERVER A J. Increased activity and stability of poly(ethylene glycol)- modified trypsin[J]. Enzyme Microb Technol, 1992, 14(2): 150-155.

[9]ROCHA J M S, GIL M H, GARCIA F A P. Effect of additives on the activity of a covalently immobilised lipase in organic media[J]. J Biotechnol, 1998, 66(1): 61-67.

[10]HERNAIZ M J, SANCHEZ-MONTERO J M, SINISTERRA J V. Modification of purified lipases from Candida rugosa with polyethylene glycol: a systematic study[J]. Enzyme Microb Technol, 1999, 24(3): 181-190.

[11]GARCIA D, ORTEGA F, MARTY J L. Kinetics of thermal inactivation of horseradish peroxidase: stabilizing effect of methoxypoly (ethylene glycol)[J]. Biotechnol Appl Biochem, 1998, 27: 49-54.

[12]ZHANG Ziding, HE Zhimin, GUAN Guoqiang. Thermal stability and thermodynamic analysis of native and methoxypolyethylene glycol modified trypsin[J]. Biotech Tech, 1999, 13(11): 781-786.

[13]KAZAN D, ERARSLAN A. Stabilization of Escherichia coli penicillin G acylaseby polyethylene glycols against thermal inactivation[J]. Appl Biochem Biotechnol, 1997, 62(1): 1-13.

[14]ABUCHOWSKI A, van ES T, PALCZUK N C, et al. Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol[J]. J Biol Chem, 1977, 252(11): 3578-3581.

[15]徐靜. 聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的研究現(xiàn)狀及展望[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué):預(yù)防診斷治療用生物制品分冊(cè), 2004, 27(2): 75-78.

[16]ABUCHOWSKI A, MCCOY J R, PALCUK N C, et al. Effect of covalent attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase[J]. Biological Chem, 1977, 252 (11): 3582-3586.

[17]ADDOU B S, TOME D, KHEROUA O, et al. Parenteral immunization to beta-lactoglobulin modifies the intestinal structure and mucosal electrical parameters in rabbite[J]. Int Immunopharmacol, 2004, 4(12): 1559-1563.

[18]李欣, 文學(xué)方, 武涌, 等. 食物過(guò)敏源水牛乳β-乳球蛋白的交叉反應(yīng)研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(8): 149-153.

[19]孫居鋒, 李洪娟, 菅曉娟. 聚乙二醇修飾牛血紅蛋白作為紅細(xì)胞代用品的條件優(yōu)化和產(chǎn)物檢測(cè)[J]. 中國(guó)藥房, 2008, 19(31): 2419-2422.

[20]KLEBER N, KRAUSE I, ILLGNER S, et al. The antigenic response of β-lactoglobulin is modulated by thermally induced aggregation[J]. Eur Food Res Technol, 2004, 219(2): 105-110.

[21]沈小琴, 鄭海, 羅永康. 酶解對(duì)乳清蛋白抗原性影響的研究[J]. 中國(guó)乳品工業(yè), 2006, 34(6): 12-15.

[22]SPELLMAN D, MCEOVY E, CUINN G O, el al. Proteinase and exopeptidase hydrolysis of whey protein:comparison of the TNBS, OPA and pH stat methods for quantification of degree of hydrolysis[J]. International Dairy Journal, 2003, 13: 447-453.

[23]黃河. PEG修飾蛋白質(zhì)等高分子[J]. 化學(xué)推進(jìn)劑與高分子材料, 2004, 2(5): 18-22.

Effect of PEG Modification on Antigenicity of β-Lactoglobulin

CAI Xiao-fei，ZHONG Jun-zhen，LIU Cheng-mei*，LIU Wei，XU Yu-jia，LUO Shun-jing
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

β-Lactoglobulin (β-LG) was modified by suecinimidyl carbonate methoxy polyethlene glycol (SC-mPEG) under different conditions of molar ratio, reaction time and pH. The change of its antigenicity was also studied. Indirect competitive ELISA was used to detect the antigenicity of the SC-mPEG-β-LG mixture. The results indicated that the highest reduction rate of antigenicity for modified products under different conditions was 70.2% at the reaction time of 8 h and at the same time, the highest modification degree detected by TNBS was 39.1%. Meanwhile, reaction time was the major factor affecting antigenicity reduction of β-LG modified by SC-mPEG.

β-lactoglobulin；polyethylene glycol；ELISA； antigenicity

Q816

A

1002-6630(2011)17-0234-04

2011-06-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071573)；教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目(20103601110002)；國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目(SKLF-MB-201004)

蔡小飛(1985—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称沸l(wèi)生與安全。E-mail：feishh@yahoo.com.cn

*通信作者：劉成梅(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称犯咝录夹g(shù)。E-mail：chengmeiliu@yahoo.com.cn