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    動(dòng)物蛋白水解復(fù)合酶的研究

    2011-04-01 01:57:22韋漢昌韋善清何建華
    化工技術(shù)與開發(fā) 2011年10期

    韋漢昌 ,韋善清 ,何建華

    (1.廣西師范大學(xué),廣西 桂林 541004;2.廣西大學(xué),廣西 南寧 530004;3.南寧地區(qū)教育學(xué)院,廣西 南寧 530001)

    動(dòng)物蛋白的提取普遍采用單一酶水解法,但單一酶的剪切范圍小,水解度不高,所得的酶解產(chǎn)物多為多肽,分子量亦較大[1]。本試驗(yàn)以水解牛骨蛋白為對象,研究動(dòng)物蛋白水解復(fù)合酶的配制,以期提高動(dòng)物蛋白的溶出率。

    1 材料和方法

    1.1 材料和試劑

    新鮮牛肋骨,動(dòng)物瘦肉(市售);木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味酶(10 萬 U·g-1);胃蛋白酶(25萬 U·g-1);碳酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸等 (AR)。

    1.2 主要儀器設(shè)備

    PHS-3C pH計(jì) ,KDT-1000全自動(dòng)定氮儀,RE201C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,F(xiàn)W-100高速萬能粉碎機(jī),TD5A-WS離心機(jī),DZKW-4電子恒溫水浴鍋。

    1.3 方法

    1.3.1 牛骨粉的制備及酶解方法

    用切割機(jī)將新鮮牛肋骨切割成長度為3~5cm的骨塊,清水洗凈牛骨塊,剔除非骨成分。牛骨塊置于鍋中,以蒸餾水剛好浸沒為宜,微沸1h,除去殘血,取出脫脂;高壓蒸煮3~4h至牛骨軟化并與肉、脂分離,即可出鍋。用雙層紗布過濾,濾液冷至10℃除去脂肪后可用于制備骨汁粉。骨塊65℃恒溫干燥24h后進(jìn)行粗粉碎、細(xì)粉碎,過0.098mm篩。細(xì)粉碎時(shí)加入適量的環(huán)狀糊精以消除制品的腥躁氣味。

    酶解牛骨蛋白時(shí),首先將牛骨粉和水按一定的料液比混合,浸泡6h,然后在設(shè)計(jì)的酶用量、溫度、p H值及酶解時(shí)間等條件下進(jìn)行酶解。

    1.3.2 復(fù)合酶篩選方法

    以胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶及風(fēng)味酶等幾種經(jīng)濟(jì)、常用的蛋白水解酶作為篩選對象,綜合酶剪切特性、酶解溫度、酶解p H值、蛋白質(zhì)溶出率及水解液感觀等因素對它們進(jìn)行篩選,選擇中性蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味酶作為復(fù)合酶組分,并通過考察組分比例對蛋白溶出率的影響,篩選復(fù)合酶各組分的比例,最后采用四因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化蛋白提取工藝條件。

    1.3.3 蛋白質(zhì)測定方法

    各試樣蛋白質(zhì)含量的測定方法及提取液中蛋白質(zhì)濃度的測定方法參照國標(biāo)GB/T 5009.5-2003,采用凱氏定氮法測定。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 各試樣蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果

    參照國標(biāo) GB/T 5009.5-2003采用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的含量,測定結(jié)果見表1。

    表1 各試樣蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果Table 1 Detection result of protein content from different samples

    2.2 復(fù)合酶組分的篩選

    胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味酶等常用蛋白酶剪切傾向性、適宜酶解溫度、適宜酶解p H值及水解牛骨蛋白蛋白效果見表 2[3~4],其中的蛋白溶出率在酶用量 4000 U·g-1(原料質(zhì)量)、料液比 1∶6(質(zhì)量比)、水解時(shí)間 5h 及各種酶的適宜酶解溫度、適宜酶解p H值等條件下進(jìn)行測定。

    表2 各種酶水解特性及水解效果Table 2 Specificities and hydrolysis effect of different proteases

    從表2看出,使用胃蛋白酶進(jìn)行酶解時(shí)蛋白質(zhì)溶出率較高,但其水解溫度與其他酶的水解溫度相差較大,而且酸堿度須控制在pH=2.0左右,易對氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)造成破壞,酶解液渾濁、苦味,并含有大量鹽分,需增加脫鹽工藝和設(shè)備,給生產(chǎn)造成不便。木瓜蛋白酶來自植物,水解動(dòng)物蛋白的能力較弱,水解度最低;風(fēng)味酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶三者水解溫度、水解p H值接近,蛋白溶出率較高,水解液無苦味或苦味弱,含鹽量低,因此本試驗(yàn)選擇風(fēng)味酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶作為復(fù)合酶組分。

    此復(fù)合酶在水解過程中水解液pH能從起始設(shè)定的7.5自動(dòng)降至6.5左右,能充分發(fā)揮組分酶的最大活性,剪切范圍寬,有利于提高水解度;水解完成后將溶提液溫度升高到130~140℃,恒溫1h進(jìn)行Maillard反應(yīng)后,所得的水解蛋白質(zhì)能保持原有的天然香氣和味道。

    2.3 復(fù)合酶組分配比篩選

    在料液比1∶6、水解溫度55℃及水解時(shí)間5h等條件下,以酶總用量4000 U·g-1為基準(zhǔn),調(diào)節(jié)風(fēng)味酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶配比,考察蛋白質(zhì)溶出率。試驗(yàn)結(jié)果見表3。

    表3 酶配比對牛骨蛋白溶出率的影響Table 3 Effect of proteases proportion on extraction ratio of protein from ox bone

    試驗(yàn)結(jié)果表明,試驗(yàn)3牛骨蛋白溶出率最高,因此,按酶活性計(jì)算,復(fù)合酶組分配比確定為胰蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味酶的用量比例為1∶3∶2。

    2.4 酶解條件優(yōu)化

    在起始水解p H=7.5條件下,以復(fù)合酶用量、料液比、酶解溫度及酶解時(shí)間作為考察因素,各取三個(gè)水平,以牛骨蛋白溶出率為考察指標(biāo),按L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)化提取條件。水平取值、試驗(yàn)結(jié)果、極差分析及方差分析結(jié)果分別見表 4、表 5。

    表4 正交試驗(yàn)及極差分析Table 4 Orthogonal experiment and range analysis

    表5 方差分析結(jié)果Table 5 Result of variance analysis

    從表4、表5看出,極差分析結(jié)果與方差分析結(jié)果無明顯差異,四因素影響顯著性為A>B>D>C,最佳提取工藝條件為A2B1C2D3,即在起始水解 pH=7.5 條件下,復(fù)合酶用量 4000 U·g-1,料液比1∶4,酶解溫度55℃,酶解時(shí)間6h。在此條件下,牛骨蛋白溶出率67.7%。

    2.5 復(fù)合酶適應(yīng)性試驗(yàn)

    表6為復(fù)合酶及酶解能力較強(qiáng)的中性蛋白酶水解各種動(dòng)物蛋白試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)條件為料液比 1∶4、酶用量 4000 U·g-1、酶解時(shí)間 6h、酶解溫度55℃,復(fù)合酶酶解起始pH值7.5,中性蛋白酶酶解 pH 值 7.0。

    試驗(yàn)結(jié)果顯示,復(fù)合酶水解各類動(dòng)物蛋白的能力強(qiáng)于單一酶,可適用于各類動(dòng)物蛋白質(zhì)的提取。

    表6 復(fù)合酶適應(yīng)性試驗(yàn)結(jié)果Table 6 The experiments of adaptability for multienzymecomplex

    3 結(jié)論

    風(fēng)味酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶等組成的復(fù)合酶水解動(dòng)物蛋白的效果比單一酶的水解效果更好,對各種動(dòng)物蛋白的水解具有較好的適應(yīng)性。

    [1] 房新平,生慶海,王玉良,等.酶法水解牛胎盤下腳料[J].中國乳品工業(yè), 2005, 33(3):35-53.

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    [4] 張帥,黃志明,梁巧榮.雙酶法酶解文慶鯉蛋白的研究[J].現(xiàn)代食品科技, 2006,23(2): 59-61.

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