動物蛋白水解復合酶的研究

韋漢昌 ，韋善清 ，何建華

（1.廣西師范大學，廣西 桂林 541004；2.廣西大學，廣西 南寧 530004；3.南寧地區(qū)教育學院，廣西 南寧 530001）

動物蛋白的提取普遍采用單一酶水解法，但單一酶的剪切范圍小，水解度不高，所得的酶解產物多為多肽，分子量亦較大［1］。本試驗以水解牛骨蛋白為對象，研究動物蛋白水解復合酶的配制，以期提高動物蛋白的溶出率。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

新鮮牛肋骨，動物瘦肉（市售）；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、風味酶（10 萬 U·g-1）；胃蛋白酶（25萬 U·g-1）；碳酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸等 （AR）。

1.2 主要儀器設備

PHS-3C pH計 ，KDT-1000全自動定氮儀，RE201C旋轉蒸發(fā)器，F(xiàn)W-100高速萬能粉碎機，TD5A-WS離心機，DZKW-4電子恒溫水浴鍋。

1.3 方法

1.3.1 牛骨粉的制備及酶解方法

用切割機將新鮮牛肋骨切割成長度為3～5cm的骨塊，清水洗凈牛骨塊，剔除非骨成分。牛骨塊置于鍋中，以蒸餾水剛好浸沒為宜，微沸1h，除去殘血，取出脫脂；高壓蒸煮3～4h至牛骨軟化并與肉、脂分離，即可出鍋。用雙層紗布過濾，濾液冷至10℃除去脂肪后可用于制備骨汁粉。骨塊65℃恒溫干燥24h后進行粗粉碎、細粉碎，過0.098mm篩。細粉碎時加入適量的環(huán)狀糊精以消除制品的腥躁氣味。

酶解牛骨蛋白時，首先將牛骨粉和水按一定的料液比混合，浸泡6h，然后在設計的酶用量、溫度、p H值及酶解時間等條件下進行酶解。

1.3.2 復合酶篩選方法

以胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶及風味酶等幾種經濟、常用的蛋白水解酶作為篩選對象，綜合酶剪切特性、酶解溫度、酶解p H值、蛋白質溶出率及水解液感觀等因素對它們進行篩選，選擇中性蛋白酶、胰蛋白酶、風味酶作為復合酶組分，并通過考察組分比例對蛋白溶出率的影響，篩選復合酶各組分的比例，最后采用四因素三水平正交試驗優(yōu)化蛋白提取工藝條件。

1.3.3 蛋白質測定方法

各試樣蛋白質含量的測定方法及提取液中蛋白質濃度的測定方法參照國標GB／T 5009.5-2003，采用凱氏定氮法測定。

2 結果與討論

2.1 各試樣蛋白質含量測定結果

參照國標 GB／T 5009.5-2003采用凱氏定氮法測定蛋白質的含量，測定結果見表1。

表1 各試樣蛋白質含量測定結果Table 1 Detection result of protein content from different samples

2.2 復合酶組分的篩選

胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、風味酶等常用蛋白酶剪切傾向性、適宜酶解溫度、適宜酶解p H值及水解牛骨蛋白蛋白效果見表 2［3~4］，其中的蛋白溶出率在酶用量 4000 U·g－1（原料質量）、料液比 1∶6（質量比）、水解時間 5h 及各種酶的適宜酶解溫度、適宜酶解p H值等條件下進行測定。

表2 各種酶水解特性及水解效果Table 2 Specificities and hydrolysis effect of different proteases

從表2看出，使用胃蛋白酶進行酶解時蛋白質溶出率較高，但其水解溫度與其他酶的水解溫度相差較大，而且酸堿度須控制在pH＝2.0左右，易對氨基酸等營養(yǎng)物質造成破壞，酶解液渾濁、苦味，并含有大量鹽分，需增加脫鹽工藝和設備，給生產造成不便。木瓜蛋白酶來自植物，水解動物蛋白的能力較弱，水解度最低；風味酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶三者水解溫度、水解p H值接近，蛋白溶出率較高，水解液無苦味或苦味弱，含鹽量低，因此本試驗選擇風味酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶作為復合酶組分。

此復合酶在水解過程中水解液pH能從起始設定的7.5自動降至6.5左右，能充分發(fā)揮組分酶的最大活性，剪切范圍寬，有利于提高水解度；水解完成后將溶提液溫度升高到130~140℃，恒溫1h進行Maillard反應后，所得的水解蛋白質能保持原有的天然香氣和味道。

2.3 復合酶組分配比篩選

在料液比1∶6、水解溫度55℃及水解時間5h等條件下，以酶總用量4000 U·g-1為基準，調節(jié)風味酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶配比，考察蛋白質溶出率。試驗結果見表3。

表3 酶配比對牛骨蛋白溶出率的影響Table 3 Effect of proteases proportion on extraction ratio of protein from ox bone

試驗結果表明，試驗3牛骨蛋白溶出率最高，因此，按酶活性計算，復合酶組分配比確定為胰蛋白酶、中性蛋白酶、風味酶的用量比例為1∶3∶2。

2.4 酶解條件優(yōu)化

在起始水解p H＝7.5條件下，以復合酶用量、料液比、酶解溫度及酶解時間作為考察因素，各取三個水平，以牛骨蛋白溶出率為考察指標，按L9（34）正交表進行試驗設計，優(yōu)化提取條件。水平取值、試驗結果、極差分析及方差分析結果分別見表 4、表 5。

表4 正交試驗及極差分析Table 4 Orthogonal experiment and range analysis

表5 方差分析結果Table 5 Result of variance analysis

從表4、表5看出，極差分析結果與方差分析結果無明顯差異，四因素影響顯著性為A＞B＞D＞C，最佳提取工藝條件為A2B1C2D3，即在起始水解 pH＝7.5 條件下，復合酶用量 4000 U·g－1，料液比1∶4，酶解溫度55℃，酶解時間6h。在此條件下，牛骨蛋白溶出率67.7%。

2.5 復合酶適應性試驗

表6為復合酶及酶解能力較強的中性蛋白酶水解各種動物蛋白試驗結果。試驗條件為料液比 1∶4、酶用量 4000 U·g－1、酶解時間 6h、酶解溫度55℃，復合酶酶解起始pH值7.5，中性蛋白酶酶解 pH 值 7.0。

試驗結果顯示，復合酶水解各類動物蛋白的能力強于單一酶，可適用于各類動物蛋白質的提取。

表6 復合酶適應性試驗結果Table 6 The experiments of adaptability for multienzymecomplex

3 結論

風味酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶等組成的復合酶水解動物蛋白的效果比單一酶的水解效果更好，對各種動物蛋白的水解具有較好的適應性。

［1］ 房新平，生慶海，王玉良，等.酶法水解牛胎盤下腳料［J］.中國乳品工業(yè)， 2005， 33（3）：35-53.

［2］ ALDER-NISSEN J.Enzymatic hydrolysis of food protein［M］.London： Elsevier Applied Science Publishers Ltd，1986： 25-40.

［3］ 吳敏，尹彥洋，羅愛平，等.雙酶分步水解牛骨蛋白工藝的優(yōu)化［J］.食品科學，2009，30（20）：223-226.

［4］ 張帥，黃志明，梁巧榮.雙酶法酶解文慶鯉蛋白的研究［J］.現(xiàn)代食品科技， 2006，23（2）： 59-61.