促紅細(xì)胞生成素對缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用

吳錦波 吳平生

促紅細(xì)胞生成素是由腎皮質(zhì)與髓質(zhì)相交處的球旁細(xì)胞等構(gòu)成的一種糖蛋白類激素，具有刺激骨髓造血的功能。EPO與其受體（EPOR）結(jié)合后,刺激紅系祖細(xì)胞增殖、分化、成熟,抑制其凋亡,從而增加成熟紅細(xì)胞的數(shù)量。對機(jī)體供氧狀況發(fā)揮重要的調(diào)控作用,可治療各類貧血。對EPO藥理機(jī)制的研究深入后發(fā)現(xiàn)其具備抗氧化、抗凋亡、抗炎、促干細(xì)胞遷移與促血管生成等功能[1-3]，并且對心肌缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury,IRI）有保護(hù)作用[4]。

1 促紅細(xì)胞生成素的生物學(xué)特性

1.1 EPO的分子結(jié)構(gòu)

EPO屬唾液糖蛋白激素，是一種人體內(nèi)源性化合物，分子量為34kD，循環(huán)中的EPO是由165個氨基酸殘基組成[5]；由基因重組技術(shù)合成的rhEPO分子量為30.4kD。皮下注射的rhEPO生物利用度是23%～42%，靜脈給予的rhEPO半衰期是4～12h。在肝臟中促紅細(xì)胞生成素分子經(jīng)過特異性的結(jié)合被清除[6]。

發(fā)揮EPO的生物活性的基礎(chǔ)是29位、33位和7位、160位半胱氨酸間所形成的兩個二硫鍵。兩個二硫鍵破壞會丟失EPO的生物活性，烷基化半胱氨酸巰基會永久喪失EPO的生物活性[7]。

1.2 EPO的受體

人的EPO受體基因位于19號染色體短臂24區(qū)[8]，共有氨基酸殘基507個和類型1跨膜蛋白域1個。前面的24個氨基酸殘基為1個信號肽,另外483個氨基酸殘基：236個氨基酸殘基胞內(nèi)域、223個氨基酸殘基胞外域與24個氨基酸殘基跨膜域。EPOR共有3個功能域：胞外域是EPOR的關(guān)鍵分化功能域，胞外域的特征是1個Trp-Ser-X-Trp-Ser近膜結(jié)構(gòu)與1套半胱氨酸殘基。EPOR胞內(nèi)域有BOX1與BOX2保守區(qū)，沒有酪氨酸激酶活性。學(xué)者提出EPOR復(fù)合體的工作模型:即EPO激活EPOR使得兩個單體二聚化,以EPO結(jié)合蛋白互連，通過啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對細(xì)胞核內(nèi)的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而對細(xì)胞存活、分化和增殖進(jìn)行調(diào)節(jié)[9]。

1.3 EPO介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

EPO沒有內(nèi)源性酪氨酸激酶活性卻能誘導(dǎo)蛋白酪氨酸磷酸化。EPO分子和EPOR相結(jié)合會使得受體二聚化。附著在EPOR上的蛋白酪氨酸激酶-2分子通過與另一個蛋白酪氨酸激酶-2發(fā)生作用并被激活,接著JAK-2會磷酸化。激活的蛋白酪氨酸激酶-2分子會將EPOR胞內(nèi)域的酪氨酸磷酸化,接著磷酸化酪氨酸由胞內(nèi)蛋白的Src同源2區(qū)吸引到EPOR上,使得蛋白酪氨酸發(fā)生磷酸化并激活，如，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-5(STAT-5)等。這一系列事件導(dǎo)致了目標(biāo)細(xì)胞發(fā)生一系列反應(yīng)從G1期向S1期過渡。大約30min的EPO介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的持續(xù)后,酪氨酸磷酸化EPOR的結(jié)合位點(diǎn)和SH-PTP1的SH2區(qū)相結(jié)合，最終增殖信號停止。EPO介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)非常復(fù)雜，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt可能與EPO心肌保護(hù)作用有關(guān)，EPO對心肌的保護(hù)作用中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制將會成為今后的研究重點(diǎn)之一。

2 EPO對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

心肌缺血再灌注損傷會導(dǎo)致4類心功能的障礙，包括：①心肌頓抑，是指心臟在冠脈血流已恢復(fù)正常或接近正常后繼續(xù)存在機(jī)械性功能障礙，是一種可逆性損傷，通常在數(shù)天或數(shù)周后恢復(fù)；②無復(fù)流現(xiàn)象，是指梗死相關(guān)冠脈再通時微血管血流遇到阻止，缺血區(qū)域不能得到有效的再灌注；③再灌注心律失常；④致死性再灌注損傷。鈣反常、氧反常、炎癥反應(yīng)與pH反常等均可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷與死亡，從而引發(fā)心肌缺血再灌注的損傷。研究已經(jīng)證明，EPO及其受體在心血管系統(tǒng)有廣泛表達(dá)[10]，通過抗凋亡、抗氧化、促血管生成、抗炎和促進(jìn)干細(xì)胞的遷移等作用機(jī)制參與心肌保護(hù)。

2.1 促紅細(xì)胞生成素的抗凋亡作用

心肌缺血再灌注損傷和細(xì)胞凋亡成正比，細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷的環(huán)節(jié)之一[11]。為了了解凋亡對心臟的影響，學(xué)者通過各種方法抑制凋亡過程來觀察心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化，結(jié)果證明，抑制心肌細(xì)胞凋亡能夠減少缺血再灌注后的心肌梗死體積幾乎達(dá)到50%～70%，改善心功能。因此抗凋亡對防治心肌缺血再灌注損傷具有十分重要的意義。

在EPO抗IRI的研究中，對EPO的抗凋亡作用研究最多。通過對凋亡信號途徑和EPO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分析，EPO在心肌缺血再灌注損傷中抗凋亡作用的可能機(jī)制為：Caspase家族蛋白酶具有半胱氨酸蛋白酶類和特異酶切Asp氨基位點(diǎn)兩大特點(diǎn)，正常狀態(tài)下無活性形式存在，經(jīng)凋亡信號刺激后活化，被認(rèn)為是凋亡過程中關(guān)鍵的通路，但并非是唯一的通路，凋亡的發(fā)生是一組Caspase級聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果[12]。有關(guān)研究指出死亡受體/胱冬肽酶-8和線粒體/胱冬肽酶-9是心肌細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)兩條主要通路，兩條信號途徑共有的下游通路是Caspase-3，促紅細(xì)胞生成素能夠阻斷凋亡信號的下傳途徑來減少凋亡。促紅細(xì)胞生成素通過和心肌細(xì)胞表面的EPOR相互結(jié)合可以起到以下作用：第一，抗凋亡蛋白上調(diào)并對促凋亡蛋白進(jìn)行抑制。第二，對 Caspase酶家族進(jìn)行抑制。促紅細(xì)胞生成素由Bcl-XL和PKB對凋亡信號途徑中的Caspase酶的激活進(jìn)行抑制。PKB對Caspase-9可以直接抑制，Bcl-XL可以和Caspase-9構(gòu)成多聚蛋白質(zhì)復(fù)合體對Caspase-9的激活進(jìn)行抑制，進(jìn)而阻斷凋亡信號的下傳。

2.2 促紅細(xì)胞生成素的抗氧化作用

王征等在離體鼠心灌注實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，促紅細(xì)胞生成素經(jīng)過短時灌注或預(yù)處理能夠抗脂質(zhì)過氧化，使得氧自由基減少生成和心肌缺血再灌注損傷減輕。朱姝等以左冠脈穿線結(jié)扎法制備心肌缺血再灌注模型，造模前24h開始給予EPO腹腔注射，能增加抗氧化酶超氧化物岐化酶(SOD)活力，減低反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度的丙二醛(MDA)的含量，說明EPO預(yù)處理可以明顯減輕IRI引起的氧化應(yīng)激[13]。

氧化應(yīng)激是心肌細(xì)胞凋亡的重要介導(dǎo)因素。結(jié)合抗凋亡研究，有學(xué)者提出EPO減少氧自由基生成，抗氧化的可能機(jī)制?？沟蛲龅鞍啄軌蜃柚沟蛲龅鞍灼茐木€粒體，PKB能夠?qū)€粒體去極化進(jìn)行阻止，這些均能夠阻止線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C的釋放從而保證呼吸鏈的完整和線粒體的穩(wěn)定，進(jìn)而對氧自由基的生成進(jìn)行抑制。促紅細(xì)胞生成素也可以間接地減輕抗凋亡蛋白（Bcl-XL、Bcl-2等）再灌注鈣的超載，使得線粒體質(zhì)子增加外排和細(xì)胞鈣、pH的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而保證氧自由基生成減少[14]。

2.3 促紅細(xì)胞生成素的促血管生成作用

促紅細(xì)胞生成素具有良好的促血管新生作用，能夠使得正常血管的新生提前12～24h。促紅細(xì)胞生成素既能夠保持血管的內(nèi)皮細(xì)胞完整性，又能夠在無血管區(qū)使得血管發(fā)生進(jìn)而形成新的毛細(xì)血管。促紅細(xì)胞生成素的促血管新生效應(yīng)也許對心功能恢復(fù)和心室的重構(gòu)起到重要的保護(hù)作用。

有關(guān)研究指出促紅細(xì)胞生成素可以增生血管內(nèi)皮細(xì)胞，使得細(xì)胞間的質(zhì)金屬蛋白酶-2增加生成，并促進(jìn)介導(dǎo)早期血管和晚期血管的生成。促紅細(xì)胞生成素可以促進(jìn)生成新血管的部分原因是紅細(xì)胞生成素使得內(nèi)皮祖細(xì)胞從骨髓中分離出來。

2.4 促紅細(xì)胞生成素的抗炎作用

促紅細(xì)胞生成素可以有效地減少致炎因子釋放以及炎性細(xì)胞浸潤，進(jìn)而起到抗炎的作用[15]。研究指出：促紅細(xì)胞生成素預(yù)處理能夠?qū)θ毖鯊?fù)氧損傷之后的心肌細(xì)胞和基因表達(dá)進(jìn)行抑制[16]。促紅細(xì)胞生成素可以對核因子-κB(NF-κB)的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)進(jìn)而起到抗炎的作用。促紅細(xì)胞生成素可以對中性粒細(xì)胞的浸潤進(jìn)行抑制從而使得髓過氧化物酶的活性降低，進(jìn)而降低炎性細(xì)胞因子IL-6、ICAM-1和TNF-a的釋放，起到抗心肌IRI的作用[17]。

2.5 促紅細(xì)胞生成素的其它作用

Lipsic等[18]最近進(jìn)行的研究已得到初步顯示,22位初次急性MI的患者一次性給予darbepoetinα (長效的EPO類似物)300μg,72h后與對照組比較,紅細(xì)胞比容沒有明顯的差別,而內(nèi)皮祖細(xì)胞(CD34+/CD45-)增多,4月后兩組的左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,未發(fā)現(xiàn)明顯的副作用。結(jié)果表明,在急性MI時一次性靜脈高劑量給予darbepoetinα是安全且可耐受的,并可刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞的動員。相關(guān)研究指出rhEPO可以減少心肌梗死面積，進(jìn)而起到保護(hù)作用[18]。這和保存ATP與心肌細(xì)胞能量代謝以及心肌細(xì)胞的調(diào)亡抑制有著密切關(guān)聯(lián)。

3 EPO心肌保護(hù)作用的給藥時機(jī)與劑量

促紅細(xì)胞生成素的攝入時間對心肌保護(hù)中的作用有著重要的影響。促紅細(xì)胞生成素在缺血前后和再灌注時給藥都可以對心肌起到一定的保護(hù)作用[19]。然而，促紅細(xì)胞生成素的具體給藥時間和心肌保護(hù)方面的效果仍然需要深入的研究。目前，促紅細(xì)胞生成素的使用劑量沒有達(dá)成一致，實(shí)驗(yàn)的劑量通常是以促紅細(xì)胞生成素在其它的器官保護(hù)中采用劑量為參考[20]。Besarab等學(xué)者指出在抗IRI上促紅細(xì)胞生成素的單次給藥(1000～5000U/kg)就能夠?qū)π募∑鸬斤@著的保護(hù)作用，同時指出了長期使用促紅細(xì)胞生成素的副作用，如心絞痛患者的死亡率升高和高血壓等[21]。

4 問題與展望

目前認(rèn)為EPO不僅能促進(jìn)紅細(xì)胞的存活、分化與增殖，還能夠作為細(xì)胞保護(hù)的因子對多個器官缺血再灌注和炎癥下的損傷起到重要保護(hù)作用。促紅細(xì)胞生成素可以起到激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑、增加心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的抗凋亡以及抗炎癥損傷作用，在減少缺血再灌注壞死心肌的面積和心室功能恢復(fù)等方面起到關(guān)鍵保護(hù)作用。然而上述研究的對象大部分為動物，促紅細(xì)胞生成素的用量也大大超出了臨床的用量[22-23]。所以對促紅細(xì)胞生成素的抗IRI作用還有待于進(jìn)一步地研究，并對促紅細(xì)胞生成素的作用機(jī)制、使用劑量、時機(jī)以及安全性和耐受性等進(jìn)一步的探索。我們相信，隨著不斷的深入研究，促紅細(xì)胞生成素能夠在心血管疾病臨床治療上起到越來越重要的作用，促紅細(xì)胞生成素會有著更加廣泛的應(yīng)用前景。

[1] Cai Z，Dominador J，Wei G，et a1．Hearts from rodents exposed to intermittent hypoxia or erythropoietin are protected against ischemiareperfusion injury [J].Circulation，2003，108(1)：79-85．

[2] Jaquet K，Krause K，Tawakol-Khodai M，et a1．Erythropoietin and VEGF exhibit equal angiogenic potential [J].Microvasc Res，2002，64(2):326-333.

[3] Shingo T，Sorokan ST,Shimazaki T,et al．Erythropoietin regulates the in vitro and in vivo production of neuronal progenitors by mammalian forebrain neural stem cells [J]．J Neurosci，2001，21(24)：9733-9743．

[4] Parsa CJ,Kim J,Riel RU,et al.Cardioprotective effects of erythropoietin in the reperfused ischemic heart:a potential role for cardiac fibroblasts [J].J Biol Chem，2004，279(20)：20655-20662.

[5] Li F,Chong ZZ,Maiese K.Erythropoietin on a tightrope:balancing neuronal and vascular protection between intrinsic and extrinsic pathways [J].Neurosignals,2004,13(6):265-289.

[6] Dube S，F(xiàn)isher JW，Powell JS，et al.Glycosylation at specific sites of erythropoietin is essential for biosynthesis,secretion,and biological function [J].J Biol Chem，1988,263 (33):17516-17521.

[7] Wang FF，Kung CK，Goldwasser E.Some chemical properties of human erythropoietin [J].Endocrinology,1985,116(6):2286-2292.

[8] 李靜，王亞平.促紅細(xì)胞生成素與紅細(xì)胞生成的調(diào)控[J].國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊,2001,22(5):239-241.

[9] 張映輝，鄧?yán)^先.紅細(xì)胞生成素受體研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,1999,10(1):38-45.

[10] Wu H，Lee SH，Gao J，et a1.Inactivation of erythropoietin leads to defects in cardiac morphogenesis [J]．Development，1999，126(16)：3597-3605．

[11] Saraste A,Pulkki K,Kallajok M,et al.Apoptosis in human acute myocardial infarction [J].Circulation,1997,95(2):320-323.

[12] 謝俊然，郁麗娜，段世明.心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡的分子調(diào)節(jié)機(jī)制[J].國外醫(yī)學(xué):麻醉學(xué)與復(fù)蘇分冊,2005,26(4):226-228.

[13] 朱妹，王士雯,吳海云，等.紅細(xì)胞生成素對大鼠心肌缺血-再灌注后抗氧化酶及NO等的影響[J].心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2005,14(5):437-440.

[14] Chong ZZ,KangJQ,Maiese K.Angiogenesis and plasticity:role of erythropoie -tin in vascular systems [J].J Hematother Stem Cell Res，2002,11(6):863-871.

[15] Heeschen C，Aicher A，Lehmann R，et a1．Erythropoietin is a potent physiologic stimulus for endothelial progenitor cell mobilization [J]．Blood，2003，102(4)：1340-1346．

[16] Agnello D，Bigini P，Villa T，et a1．Erythropoietin exerts an antiinflammatory effect on the CNS in a model of experimental autoimmune encephalomyelitis [J]．Brain Res，2002，952(1)：128-134．

[17] Liu X，Xie W，Liu P，et al.Mechanism of the cardioprotection of rhEPO pretreatment on suppressing the inflammatory response in ischemiareperfusion [J].Life Sci，2006,78(19):2255-2264.

[18] Lipsic E,van der Meer P,Henning RH,et al.Timing of Erythropoietin Treatment for Cardioprotection in Ischemia/Reperfusion [J].J Cardiovasc Pharmacol,2004,44(4):473-479.

[19] 秦川，肖穎斌，鐘前進(jìn)，等．EPO預(yù)處理對心肌缺氧復(fù)氧損傷保護(hù)作用的研究[J]．重慶醫(yī)學(xué)，2005，34(5)：734-737.

[20] Gorio A，Gokmen N，Erbayraktar S，et al，Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma [J]．Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(14)：9450-9455.

[21] Besarab A，Bolton WK，Browne JK，et al.The effects of normal as compared with low hematocrit values in patients with cardiac disease who are receiving hemodialysis and epoetin [J].N Engl J Med，1998,339(9):584-590.

[22] van der Meer P，Lipsic E，Henning RH，et al.Erythropoietin improves left ventricular function and coronary flow in an experimental model of isehemia-reperfusion injury [J].Eur J Heart Fail，2004,6(7):853-859.

[23] Parsa CJ，Matsumoto A，Kim J，et al.A novel protective effect of erythropoietin in the infracted heart [J].J Clin Invest,2003,112(7):999-1007.